مقاله تاندون

مهندسی بافت و پزشکی بازساختی تاندون: گذشته، حال، آینده

دکتر علی مشیری

متخصص جراحی دامپزشکی

۱درمانگاه دامپزشکی دکتر مشیری، تهران، ایران dr.ali.moshiri@gmail.com

هدف- بررسی وضعیت مهندسی بافت تاندون و پیش بینی آینده تحقیقات مرتبط با آن در جهان

طرح-مطالعه مروری

روش-بررسی مقالات تحقیقاتی در حوزه ترمیم، مهندسی بافت و پیوند تاندون در پایگاه های اسکولار، پاب مد، اسکوپوس و ISI و تفسیر نتایج مطالعات in vitro و in vivo مدل حیوانات آزمایشگاهی

نتایج- ترمیم تاندون های آسیب دیده به دلیل پیچیدگی ساختارهای کلاژنی و خونرسانی های ناپایدار و غیر موثر در حین پروسه التیام، مشکل است. تلاش های زیادی برای بازسازی تاندون های آسیب دیده شده است که می توان به استفاده از اتوگرافت، آلوگرافت و زنوگرافت اشاره کرد. مشکل اساسی عدم تعریف و تفسیر بسیاری از رویدادهای طبیعی در پاسخ بدن به ترمیم بافت های تاندونی می باشد. مواردی چون تنواینداکشن، تنواینکورپوریشن، تنوکانداکشن و تنوژنز اساسا به درستی تعریف نشده اند و نیاز به بازتعریف دارند. وقتی تعریف درستی ارائه نشود، استراتژی های درمانی نادرستی به کار گرفته می شود. درسالهای اخیر، مهندسی بافت تاندون به کمک مطالعات حوزه ترمیم تاندون آمده و در این میان پیوند بین مهندسی و پزشکی بازتعریف بسیاری از پایه های علم ترمیم تاندون را به یک مساله مهم تبدیل کرده است. فناوری هایی چون الکتروریسی، پلی مریزاسیون، اسکنر ها و پرینتر های سه و چهاربعدی و freeze drying، به کار گرفته شده اند تا داربست هایی دو و سه بعدی را برای جایگزینی تاندون های آسیب دیده بسازند. در این میان پژوهشگران هنوز در انتخاب موادی که بتوانند به بهترین شکل روند ترمیم تاندون را تحریک نماید، به جمع بندی نرسیده اند. عده ای از مهندسی بافت برای ساخت ایمپلنت هایی غیر زنده جهت جایگزینی دایمی تاندون استفاده کرده اند و دیگران به فکر بازسازی طبیعی تاندون از طریق پیوند ساختار های زنده و یا مرده ای هستند که به تدریج رشد تاندون جدید را تحریک نماید. در این میان استفاده توامان از سلول های بنیادی و تمایز یافته و فاکتور های محرک ترمیم به پیچیدگی این بحث دامن زده است. در آینده تحقیقاتی موفق ترند که شبیه سازی بیشتری از بافت تاندون در مراحل مختلفی از روند تکامل آن ارائه دهند با این هدف که استراتژی های آن ها به واقعیت بدن موجودات زنده نزدیک تر باشد.

نتیجه گیری و کاربرد بالینی-مهندسی بافت و پزشکی بازساختی تاندون نیاز به بازتعریف بسیاری از مفاهیم دارد تا بتواند بر اساس نیاز واقعی بدن، استراتژی درمانی جدیدی را طراحی نماید که پاسخگوی نیاز واقعی بیماران باشد.

واژگان کلیدی- مهندسی بافت، تاندون، ترمیم، پزشکی بازساختی، آینده

مقدمه

تاندون یک بافت پیوندی مستحکم و متشکل از تارچه ها و تارهایی از جنس ملکول های کلاژن می باشد که در یک هم آرایی زیبا در قالب فاسیکل ها متحد شده اند و اندوتنون و اپی تنون و پاراتنون آنها را در برگرفته اند (۱). تاندون، عضله را به استخوان متصل نموده و حرکت پذیری مفاصل را امکان پذیر می نماید. بنابراین تاندون نقش مهمی در حرکت کردن همه موجودات زنده دارد (۲). متاسفانه با افزایش فعالیت های بدنی، پیری، عادات غلط وزن گذاری و توزیع وزن بر روی اندام، و دلایل متعدد دیگر، مانند شکستگی های استخوانی، سوختگی، تروما های برنده و کند، تیر خوردن و موج انفجار و همینطور در حین بسیاری از فعالیت های ورزشی مانند فوتبال، بوکس، تنیس، ژیمناستیک و غیره تاندون نیز مانند هر بافت زنده دیگری در بدن می تواند دچار آسیب شده به طوریکه این آسیب در نهایت منتج به پارگی تاندون و از هم گسیختگی توزیع پیوسته نیروهای وزن گذاری در راستای رشته های کلاژن تشکیل دهنده تاندون شود (۳).

مهم ترین آسیب های تاندون شامل پارگی های کامل، نقیصه های تاندون، و ضایعات دژنراتیو تاندون می باشد. درمان های جراحی شامل بخیه کردن لبه های تاندون پاره شده با استفاده از الگوهای مختلف بخیه (مانند کسلر، Bunnel-Meyer، Bunnel-crisscross، Tajima، Three loop pulley، دور در دور – نزدیک در نزدیک)، پیوند تاندون در نقیصه ها (اتوگرافت، آلوگرافت، زنوگرافت، ایمپلنت کردن)، و دبریدمان تاندون (ایجاد برش های طولی به منظور افزایش خونرسانی) در ضایعات دژنراتیو می باشد (۴-۶). متاسفانه ترمیم تاندون بسیار کند بوده و احتمال پارگی مجدد و چسبندگی بافت تازه رویش یافته به سایر بافت های اطراف تاندون از مهم ترین معضلات روند ترمیم می باشد. بدیهی است که روش های کلاسیک ترمیم جراحی تاندون ایده آل نیستند و با عوارض متعددی همراه می باشند که نیاز به جراحی های اصلاحی بعدی را در بسیاری از موارد تضمین می نمایند (۴).  

مهندسی بافت و پزشکی بازساختی تاندون، حوزه ای جدید از علم و فناوری است که نویدبخش ابداع و به کارگیری از روش های جدید درمانی به منظور تسریع روند ترمیم و بازسازی طبیعی تاندون از دست رفته به خصوص در محل ضایعه دیده می باشد؛ به طوریکه تاندون جدید تشکیل یافته بتواند خواص بیوشیمیایی، موروفولوژیک و بیومکانیک تاندون سالم و طبیعی را بازسازی نموده و الگوی طبیعی وزن گذاری و حرکت پذیری مفصل را در بیماران درمان شده بهبود بخشد (۱).

هدف از مطالعه

در سال های اخیر مطالعات زیادی در حوزه مهندسی بافت و پزشکی بازساختی تاندون در سطح جهان انجام شده است ولی به دلیل پراکندگی مطالعات و اهداف و نتایج آنها، جمع بندی وضعیت مهندسی بافت تاندون و پیش بینی آینده تحقیقات مرتبط با آن در جهان مشکل می باشد. بر این اساس مطالعه مروری حاضر طراحی شد تا به بررسی وضعیت مهندسی بافت تاندون و پیش بینی آینده تحقیقات مرتبط با آن در جهان بپردازد با این هدف که یک مسیر روشن از وضعیت موجود و آینده جهت استفاده پژوهشگران و جراحان این حوزه ارائه دهد.

روش کار

بررسی مقالات تحقیقاتی در حوزه ترمیم، مهندسی بافت و پیوند تاندون در پایگاه های اسکولار، پاب مد، اسکوپوس و ISI و تفسیر نتایج مطالعات in vitro و in vivo مدل حیوانات آزمایشگاهی، بیماران حیوانی و بیماران انسانی در سطح کارآزمایی بالینی. از بیش از ۱۸۰۰ مقاله یافت شده با موضوع مهندسی بافت تاندون، مقالاتی که به طور مکانیستیک به  پاسخ های لازم برای توضیح تنوژنز، تنواینداکشن، تنوکانداکشن، تنواینکورپوریشن و تنواینتگریشن دست یافته بودند به طور جداگانه بررسی شدند و همچنین مقالاتی که هر کدام کاربردی از مهندسی بافت شامل طراحی و استفاده از داربست ها، زیست مواد های محرک ترمیم و سلول های بنیادی را بسط و گسترش داده بودند انتخاب شدند. با توجه به کمبود کارآزمایی های بالینی در این حوزه، عمده اطلاعات ارائه شده در این مقاله از پژوهش هایی اقتباس شده است که در حوزه های in vitro و in vivo انجام شده بودند. کلیه مقالات به جز مقالات نویسنده این مقاله مروری، از بین تحقیقات ژانویه ۲۰۱۷ الی مارچ ۲۰۱۹ انتخاب شده اند.

ترمیم و آسیب های تاندون

روند ترمیم تاندون پس از یک دوره وقفه چند ساعته تا چند روزه، با مرحله آماسی و ورود سلول های ایمنی بدن به محل ضایعه و درنتیجه التهاب محل آسیب دیده آغاز می گردد و در این میان لنفوسیت ها، نوتروفیل ها و ماکروفاژ ها نقش مهمی در پاکسازی بافت های مرده ایفا می کنند و علاوه بر این ماکروفاژها زمینه سازی لازم برای ایجاد پاسخ های سلولی لازم جهت ورود پاسخ ترمیمی به مرحله بعدی یعنی فاز تنوپلازی را انجام می دهند (۷). مرحله آماس و التهاب بسته به نوع آسیب ایجاد شده و درمان انجام شده متفاوت است و تقریبا هیچ دو موردی از بیماران، پاسخ آماسی مشابهی در این مرحله ندارند (۱). مرحله آماس و التهاب ظرف چند روز از حالت حاد به مزمن تغییر مسیر می دهد و در فاز مزمن ممکن است تا ماه ها به طول انجامد (۱). در فاز تنوپلازی، سلول های ترمیمی شامل تنوبلاست ها و سلول های اندوتلیال عروق خونی تکثیر و تمایز می یابند و حجم زیادی از ملکول های کلاژن نوع سه را در غالب تارچه های کلاژن تولید می کنند که با گذشت زمان و ورود به فاز بلوغ بافتی، از تعداد آنها کاسته می شود، و بر قطر تارچه های کلاژن افزوده می شود و به تدریج کلاژن های نوع یک غالب می شوند (۷). در این مرحله اخیر است که نیروهای مکانیکی با قدرت بیشتری درون بافت تاندون در حال ترمیم نفوذ می کنند و تارچه های کلاژن را در راستای جهت ورود و خروج خود منظم می کنند؛ امری که منجر به پدید آمدن تدریجی تارهای کلاژن در غالب دستجات تارچه ای کلاژن می گردد و به تدریج فاز بلوغ تا سال ها ادامه می یابد تا فاسیکل ها و اندوتنون و پاراتنون و اپی تنون جدید شکل بگیرد (۸). آنچه گفته شد یک روند ترمیم کلاسیک از تاندون است و در آسیب های واقعی تاندون، اگرچه همه این مراحل دیده می شود ولی به این سادگی مراحل ترمیم قابل توضیح نیست. به تجربه نگارنده، در یک بافت تاندون در حال ترمیم همه این مراحل قابل مشاهده است و بسته به نوع آسیب و درمان انجام شده، پاسخ های ترمیمی متفاوتی ممکن است دیده شود (۱).

در آسیب های کلاسیک تاندون در جراحی، پارگی های تاندون به صورت جزئی، ناقص و کامل ممکن است رخ دهد که اگر ضایعه حاد به سرعت تحت درمان قرار گیرد پاسخ ترمیمی به مراتب متفاوت تر از حالت مزمن پارگی می باشد (۸). در حالت مزمن پارگی کامل تاندون، لبه های پاره شده تاندون به بافت های اطراف می چسبند، گپ بین دو لبه تاندون بسیار بزرگ تر شده و بخش مهمی از مراحل ترمیم تاندون انجام شده است و باید با تکنیک های جراحی، دوباره بدن را متوجه آسیب تاندون به گونه ای نمود تا ترمیمی هدفمند آغاز گردد (۱). معمولا در از دست رفتن بافت تاندون که حتی در موارد پارگی های مزمن تاندون نیز دیده می شود، بخیه لبه های باقی مانده تاندون امکان پذیر نیست و گپ به وجود آمده باید با استفاده از گرافت ها و یا سازه های مهندسی شده تاندون پر شوند و فاز آماسی دوباره فعال شود (۹و ۱۰). ضایعات دیگری نیز مانند تندینوپاتی وجود دارند که علایم بالینی آنچنانی ندارند و به تدریج تاندون را مضمحل کرده و پارگی های مزمن تاندون را ایجاد می نمایند (۶). بخش دیگری از آسیب های تاندون چسبندگی تاندون ها به یکدیگر و یا به بافت های اطراف است که می تواند در اثر ضایعات حاد و مزمن به وجود آید (۷). اما نکته آخر در مورد ضایعات تاندون، بلند شدن تاندون از محل اتصال به استخوان یعنی جاییست که به آن انتسیس یا محل گذار گفته می شود که این بخش از تاندون-استخوان شامل بافت تاندون، فیبروغضروف و استخوان می باشد که ترمیم این قسمت از تاندون نیز به دلیل وجود سه ناحیه مختلف از هم بسیار مشکل است (۱۱). مهم ترین مشکلات روند ترمیم تاندون، گپ های ایجاد شده، پارگی مجدد و چسبندگی به بافت های اطراف می باشد (۷).

روش های درمانی کلاسیک

پارگی های تاندون در فاز حاد مستقیما بخیه می شوند (۱۲). ولی محل اتصال دو لبه تاندون برای ترمیم باید تحریک شود که استفاده از داروهای ضد التهاب، تمرینات بدنی، مکمل های خوراکی، فیزیوتراپی از طریق تنس عضلانی و جریان الکتریکی، لیزر کم توان، امواج فراصوت و آب درمانی و گرم درمانی از جمله درمان های انجام شده تا به امروز است (۱۳). در مورد پارگی های مزمن و سایر مواردی که بین دو لبه تاندون گپ به وجود می آید، استفاده از اتوگرافت ها در انسان و حیوان بسیار شایع است لکن استفاده از اتوگرافت ها معایبی دارد. به عنوان مثال استفاده از اتوگرافت زمان جراحی را طولانی می کند، یک آسیب جدید دیگری در بدن ایجاد می شود، از نظر زیبایی مشکل زاست، و ممکن است بافت دهنده مناسبی برای ضایعه ای که با آن بر خورد داریم پیدا نشود. در مقابل استفاده از آلوگرافت ها مطرح است. اشکال استفاده از آلوگرافت ها احتمال رد پیوند، و انتقال بیماری های مشترک و نیز مسائل اخلاقی و قیمت آن است. در مقابل زنوگرافت ها به صورت تازه اصلا کاربردی در دنیای واقعی درمان ندارند و باید به فکر جایگزین های تاندون بود (۱ و ۱۲).

مهندسی بافت و پزشکی بازساختی تاندون

در سالهای اخیر علوم مختلفی از مهندسی و پزشکی استفاده شده است تا برای حل معضلات و آسیب های تاندون راه حل های مختلف و درمان های هدفمندی ارائه شود. حوزه هایی مانند جراحی، اورتوپدی، مهندسی مکانیک، زیست فناوری، علوم و فناوری های مرتبط با سلول های بنیادی، علوم دارویی، شیمی، زیست مواد، و مهندسی پزشکی با یکدیگر به طوری آمیخته اند تا استراتژی های درمانی جدیدی در راستای ترمیم تاندون های آسیب دیده طراحی شود با این هدف که بافت جدید رویش یافته از ماحصل این استراتژی های درمانی مختلف، بتواند حداکثر خواص یک تاندون سالم و دست نخورده را در بدن بیمار، شبیه سازی نموده و عملکرد طبیعی داشته باشد (۱۲).

از نظر کلاسیک، مهندسی بافت تاندون اهدافی را پوشش می داد که در آن تاندون آسیب دیده با جایگزین های بافتی مانند بیوایمپنت های پایدار و یا گرافت های خودی و غیر خودی به روش جراحی ترمیم می شد و فقط عملکرد بافت نهایی مدنظر بود (۱۲). مهندسی بافت و پزشکی بازساختی تاندون به مفهوم جدید، حوزه ای از علم و فناوری است که در آن با استفاده از داربست ها، فاکتور های محرک ترمیم و ساختار های سلولی، ضروریات مورد نیاز یک روند ترمیم به گونه ای فراهم می گردد تا تاندون جدید تشکیل یافته جایگزین تاندون از دست رفته و جایگزین های بافتی حاصل از فناوری های مهندسی بافت گردد و بتواند عملکرد یک تاندون سالم را در بدن بیمار فراهم نماید (۱). به عبارت دیگر، در قدیم، تنها تاندون آسیب دیده با استفاده از محصولات مهندسی بافت تحت ترمیم جراحی قرار می گرفت و روند ترمیم طبیعی تاندون خیلی مد نظر نبود. در این حالت ممکن است محصول مهندسی بافت شده که جایگزین تاندون آسیب دیده شده است، تا سال ها بدون تغییر در بدن بیمار باقی بماند و فقط عملکرد کوتاه مدت، میان مدت و دراز مدت آن مد نظر بود (۱۴). اما مهندسی بافت تاندون در مفهوم جدید روند ترمیم تاندون را هدف گرفته است به گونه ای که سازه های مهندسی شده تاندون نه تنها باید در کوتاه مدت عملکرد مکانیکال تاندون سالم را شبیه سازی کنند بلکه باید به گونه ای طراحی شوند که به تدریج با تاندون تازه ساخته شده توسط خود بدن بیمار، جایگزین شده و این تاندون تازه تشکیل شده باید خواص یک تاندون سالم را تداعی نماید (۱). این یک پیشرفت بزرگ در مهندسی بافت تاندون در سال های اخیر است که تعالی آن مرهون اضافه شدن حوزه ای به نام پزشکی بازساختی با مهندسی بافت می باشد؛ امری که امروزه خیلی مورد توجه پژوهشگران جهان قرار گرفته است.

بر اساس تعاریفی که در مهندسی کلاسیک تاندون و مهندسی بافت و پزشکی بازساختی در مفهوم جدید ارائه شد، تغییراتی در اهداف خرد و کلان در حوزه اخیر شکل گرفته است که اهمیت یافتن مفاهیمی چون زیست سازگاری، زیست تخریب پذیری، تنواینتگریشن، تنوکانداکشن، تنواینداکشن، تنوژنز و تنواینکورپوریشن در این راستا تفسیر می گردد (۷ و ۱۲). نگارنده و همکاران تحقیقاتی اش برای اولین بار در سطح جهان این مفاهیم را در حوزه مهندسی بافت تاندون برجسته و تفسیر نمودند تا پژوهشگران حال حاضر جهان، یافته های خود را بر اساس این مفاهیم تعریف نمایند، با این هدف که امکان مقایسه روش های مختلف درمان تاندون بر اساس استراتژی های مهندسی بافت ممکن شود (۱۵-۲۴).

داربست های جایگزین بافتی

داربست مهندسی شده، به محیطی مصنوعی گفته می شود که شرایط مورد نیاز برای اتصال، مهاجرت، پرولیفراسیون و تمایز سلول ها را به سلول های بافت هدف و خونرسان به نحوی محیا نماید که ماتریکس خارج سلولی جدید ساخته شده بتواند در تمامی فضاهای داربست به طور همگون و متوازن رسوب کرده و برای رشد بافت هدف هادی باشد (۲۵). از منظر نگارنده، داربستی برای مهندسی تاندون ایده آل است که ۱- سلول سازگار باشد؛ زمانی که در شرایط in vitro سلول های مختلف روی آنها کاشته می شوند و کشت می یابند، زنده مانی و اتصال و مهاجرت آن ها را تقویت نماید. ۲- زیست سازگار باشد؛ پس از پیوند درون بدن حداقل واکنش های آماسی و التهابی را تحریک نماید ولی در عین حال باید این توانایی را داشته باشد که فاز آماسی ترمیم را تحریک نماید. ۳- زیست تخریب پذیر باشد؛ به موازاتی که رویش بافت جدید تاندون در حال پیشروی در فضاهای خالی آن است، تخریب و تجزیه شده تا جایی که دیگر اثری از آن باقی نماند. ۴- تنواینداکتیو باشد؛ بتواند سلول های پیش ساز را به تنوبلاست ها تمایز دهد و ماکر های بافت تاندون را در سطح سلول های بنیادی ایجاد نماید. ۵- تنوکانداکتیو باشد؛ رشد طولی تاندون جدید تازه رویش یافته را در مسیر نیروهای وزن گذاری و مکانیکال وارد شده بین دو قسمت باقی مانده تاندون آسیب دیده هدایت کند. ۶- تنواینکورپوریتیو باشد؛ بقایای داربست بتوانند طوری با بافت جدید تاندون ادغام شوند که از منظر مورفولوژیک و مکانیکال نتوان تفاوتی بین قسمت های مختلف تاندون تازه تشکیل شده و بقایای داربست مهندسی شده قائل شد. ۷- تنواینتگریتیو باشد؛ نواحی گذار در مرز تاندون و عضله و یا تاندون به استخوان را به خوبی بازسازی نماید و ۸- تنوژنیک باشد؛ روند ترمیم تاندون را تا جایی پیش ببرد که تارچه های تمایز یافته کلاژنی، تارها، فاسیکل ها و سایر ماکروساختار های تاندون مانند اندوتنون و پاراتنون و اپیتنون را تمایز دهد و خواص بیومکانیکال تاندون طبیعی را در بافت جدید نشان دهد (۱، ۲، ۲۳، ۲۴). با بررسی مطالعات مختلف در سطح جهان و مقایسه بین رهیافت های کلاسیک و نوین مهندسی بافت تاندون، داربست های مختلفی با اهداف مختلف درمانی جهت استفاده در درمان جراحی ضایعات و آسیب های تاندون طراحی و مورد پژوهش قرار گرفته است (۲۶).  

داربست های مهندسی شده در تاندون با اهداف مختلفی ساخته می شوند که انواعی از دو و سه بعدی، و نیز تک، دو و چند فازی دارند. داربست های دو بعدی، بیشتر به منظور جلوگیری از مهاجرت تنوبلاست های ترمیمی از محل ضایعه به بافت های اطراف در حین پروسه فیبروپلازی ترمیم تاندون استفاده شده اند و بنابراین اتلاق نام داربست به این ساختار های دو بعدی که در واقع شبیه ساز غلاف تاندون می باشند، امر صحیحی به نظر نمی رسد به دلیل آنکه اساسا در بیشتر موارد سلولی وارد ساختار آنها نمی شود و اتفاقا هدف از ساخت آن ها این است تا سلولی به درون آن ها نفوذ نکند (۱ و ۲۴). این هدف قطعا با تعریف داربست مهندسی شده ناسازگار است. ولی از آن جهت که این ساختار های دو بعدی را دور نقیصه ها و ضایعات بخیه شده تاندون می پیچند تا تاندون جدید تشکیل شده در فضای خالی مرکز غلاف مصنوعی رشد کند، به این ساختار ها نام داربست می دهیم. این ساختار ها در واقع مشابه با پوشاننده های زخم های پوستی می باشند که خود در روند ترمیم مشارکت نمی کنند و بیشتر با اهداف کلاسیک مهندسی بافت تاندون سازگار می باشند (۲۴). قطعا استفاده از چنین ساختار هایی بیومکانیک طبیعی تاندون را در کوتاه مدت شبیه سازی نمی کند ولی با توجه به اینکه می تواند رشد تاندون جدید را حول محور طولی خود تحریک نماید، در دراز مدت می تواند خواص تاندونی را در محل ضایعه شبیه سازی نماید و از این جهت در مفهوم کلاسیک مهندسی بافت حائز اهمیت است (۲۴). همچنین، با توجه به اینکه از این ساختار ها جهت کاهش چسبندگی های تاندون جدید تشکیل شده به خصوص در انواع اینتراسینویالی تاندون استفاده می شود، و نیز می توان از آن ها در ترکیب با ساختار های سه بعدی تاندون مهندسی شده در غالب داربست های دوفازی نیز استفاده کرد، می توان در بیشتر استراتژی های بازساختی تاندون آسیب دیده از این داربست ها استفاده های مفیدی نمود و بنابراین نقش آن ها را نباید دست کم گرفت (۲۷). از پرده آمنیوتیک با موفقیت در درمان نقیصه های کوچک تاندون و به منظور جلوگیری از چسبندگی تاندون حین ترمیم در مدل حیوانی استفاده شده است. یکی از مزیت های مهم پرده آمنیوتیک زیست سازگاری بالای آن و سهولت تخلیه آن از ساختار های سلولی ناسازگار با بدن میزبان است (۲۸). همچنین از داربست دو بعدی پلی دیوکسانون در ترکیب با داربست سه بعدی کلاژنی جهت بازسازی نقیصه های تاندون آشیل خرگوش با موفقیت استفاده شده است و نشان داده شده است که غلاف پلی دیوکسانونی توانسته بود به طور کامل چسبندگی تاندون جدید به بافت های اطراف را مهار نماید (۱۷). جنس این داربست ها نیز مهم است و هنوز بر سر ایده آل ترین زیست مواد لازم برای ساخت داربست های دو بعدی اختلاف نظر وجود دارد. نشان داده شده است که غلاف های پلی یورتانی نسبت به پلی کاپرولاکتون و سپرا فیلم (نوعی غلاف تجاری) دارای خواص مکانیکی بالاتر، خاصیت التهابی کمتر و سرعت تخریب منظم تر و قابل پیش بینی تری می باشند و برای همین نیز در مهندسی بافت تاندون به منظور کاهش چسبندگی های تاندون توصیه شده اند (۲۹).

داربست های سه بعدی یکی از مهم ترین چالش ها در مهندسی تاندون را تشکیل می دهند (۲۶). در مفهوم کلاسیک مهندسی بافت، سازه های سه بعدی کلاسیک شامل اتوگرافت ها، آلوگرافت ها و زنوگرافت های سلولار و آسلولار و نیز سازه های سه بعدی سنتتیک غیر قابل تخریب و یا دیرتخریب پذیر می باشد (۱). در این استراتژی عملکرد آنی بافت پیوند شده به نقیصه های تاندون مد نظر است و سازه سه بعدی باید شبیه ساز خواص مکانیکال و عملکردی تاندون در فاصله اندکی پس از پیوند یا کاشته شدن در محل نقیصه تاندون باشد (۲۵).

آسلولاریزاسیون یا تهی کردن یک بافت از سلول با هدف افزیش زیست سازگاری و کاهش واکنش های آماسی انجام می شود که استفاده از مواد شوینده و آنزیم ها و روش انجماد – ذوب معمول تر است (۳۰-۳۲).  اخیرا نشان داده شده است که فریز کردن بافت تاثیر معنی داری در کاهش خواص بیومکانیک آن ندارد (۳۳). ماتریکس تهی شده از مواد معدنی استخوان دارای دبریس های سلولی می باشد که می تواند واکنش های آماسی را طوری تحریک نماید که تولید بافت در محل ضایعه تحریک شود. افزون بر این کلسیم و فسفر آن حذف شده است و دارای مقاومت مکانیکی قابل قبولی برای بازسازی تاندون های آسیب دیده می باشد و به همین دلایل برای مهندسی بافت تاندون پیشنهاد شده است (۳۴). با این حال بر اساس تجارب نگارنده ماتریکس استخوانی تهی شده از مواد معدنی به دلیل وجود ساختار های استخوانی به خصوص کنام های سلول های استخوانی بیشتر در تحریک ناحیه تاندونی استخوانی (محل اتصال تاندون به استخوان یا انتسیس) قابل استفاده است. نشان داده شده است که استفاده توامان از این ماتریکس با سلول های بنیادی مزانشیمی باعث تسریع ترمیم ناحیه انتسیس در رت شده است (۳۵). همچنین ماتریکس تاندونی آسلولار زنوژنیکی با منشا خوکی تهیه شد و سلول های تاندون انسانی درون آن کشت یافتند. نتایج نشان داد سلول های تاندون انسانی به خوبی در همه جای آن توسعه نیافته بودند. پس از پیوند به مدل حیوانی، نسبت به داربست های پلی گلیکولیک اسید (کنترل)، واکنش های آماسی بسیار کمتر بود و سلول های تاندونی به مراتب نسبت به کنترل توازن بهتری در سراسر بافت داشتند و توانستند تاندون جدیدی را در محل ضایعه بسازند (۳۶). در مطالعه ای ماتریکس کلاژنی گاو بر اساس سیستم تثبیت اپوکساید که در آن تارچه های کلاژن به خوبی حفظ می شوند با دو مدل از داربست های تجاری خوکی مقایسه شد و نشان داده شد که داربست گاوی دارای خواص مکانیکی برتر بود و میزان زنده مانی و پرولیفراسیون سلول ها را افزایش داد (۳۷). اگرچه این روش یک استراتژی موفق در کوتاه مدت می باشد ولی نتایج نشان دهنده موفقیت ضعیف این استراتژی ها در دراز مدت می باشد و پارگی مجدد و نیاز به جراحی اصلاحی در اغلب موارد، وجود دارد.

در مفهوم جدید مهندسی تاندون، سازه هایی سه بعدی ساخته شدند که اگرچه در کوتاه مدت خواص مکانیکال و عملکردی تاندون های سالم را شبیه سازی نمی کردند، ولی در دراز مدت توانستند تاندون جدیدی در محل ضایعه ایجاد نمایند؛ که دارای خواص بیوشیمیایی، مورفولوژیک، مکانیکال و عملکردی نزدیک به تاندون های سالم و دست نخورده بود (۳، ۴، ۱۰ و ۱۴). از جمله آن ها می توان به مدلی اشاره کرد که نگارنده و همکاران در طی سالها پژوهش توسعه دادند. در این مدل کلاژن های تاندون گاو به روش هضم آنزیمی تخلیص شد و مجددا با استفاده از فناوری الکترواسپینیگ در مقیاس نانو بازسنتز شد و در نهایت به صورت هیبریدی در هیدروژل کلاژنی قرار داده شد تا داربستی هیبریدی از کلاژن های میکرو و نانوساختار با نظمی نزدیک به ۹۰ درصد از یک تاندون سالم ولی با فضاهای خالی بیشتر ساخته شود (تصویر ۱). این داربست در نقیصه ۲۰ میلیمتری تاندون آشیل خرگوش ایمپلنت شد و نتایج نشان داد که داربست فوق توانسته بود ظرف ۳۰ روز با یک تاندون کاملا جدید جایگزین شود؛ تاندونی که به مرور زمان و پس از گذشت ۱۲۰ روز از پیوند داربست اولیه توانست به تنهایی حدود نیمی از خواص بیومکانیک یک تاندون سالم را پیدا نماید (۳، ۴، ۱۰ و ۱۴).

تصویر ۱: A تا E: نحوه ساخت داربست دو فازی کلاژن با استفاده از فناوری الکترواسپینینگ (تولید کلاژن نانو) و پلیمریزاسیون ژلی (تولید کلاژن میکرو) و ادغام آن ها در غالب یک داربست هیبریدی و سه بعدی جهت بازسازی نقیصه های بزرگ تاندون

با استفاده از فناوری الکترواسپینینگ، ملکول های کلاژن تخلیص شده از تاندون خم کننده با منشا گاوی به صورت رشته های منظم در مقیاص نانو در صفحه جمع آوری کننده به صورت یک صفحه دو بعدی ساخته شد و سپس ملکول های محلول کلاژن در اطراف این داربست بسیار منظم دو بعدی شروع به پلیمریزاسیون کردند. این پلیمریزاسیون در اطراف نانوتار های کلاژن باعث منظم شدن تارهای میکروساختار شد و به این صورت تارهای میکرو و نانو در داخل یک داربست ادغام شدند و داربستی سه بعدی و هیبریدی ساخته شد.

نشان داده شده است که محیط های سه بعدی نقش مهمی در تمایز سلول های بنیادی به سلول های تاندون دارد (۳۸). چون کلاژن نوع یک مهم ترین ملکول تشکیل دهنده تاندون است، بیشترین فراوانی استفاده در مهندسی بافت تاندون را دارد. در مطالعه ای نشان داده شد که داربست های سه بعدی که از کلاژن نوع ۱  بز ساخته شده بودند، کاملا زیست سازگار بودند و دارای خواص مکانیکال قابل قبولی بودند (۳۹). پارگی های تاندون روتیتور کاف به خصوص از محل اینسرشن یکی از معضلات اورتوپدی است و نشان داده شده است که هیدروژل مشتق از کلاژن نوع ۱ تاندون انسانی باعث بهبود آسیب حاد تاندون آشیل در رت شده است و در مدل آسیب مزمن نیز در محل اتصال تاندون به استخوان باعث بهبود خواص بیومکانیکی پس از پیوند شده بود (۴۰). هیدروژل ها از جمله داربست های سه بعدی با خاصیت بیومکانیک پایینی هستند ولی به عنوان حامل بسیار خوبی برای سلول های بنیادی در محل ضایعه عمل می کنند. اخیرا از هیدروژل های حساس به حرارت بوتان دیسوسیانات در ترکیب با ملکول های کلاژن به عنوان حامل سلول های پیش ساز تاندون استفاده شده است و نشان داده شده است که هیدروژل مزبور پس از تزریق در محل ضایعه می تواند در دمای بالای ۲۵ درجه سانتی گراد جامد گردد (۴۱). در مطالعه دیگری داربست دو عملکردی با خاصیت ضد چسبندگی و حامل سلول های بنیادی مزانشیمی ساخته و توسعه داده شد و از آن ها در ترمیم ضایعات تاندون خم کننده خرگوش استفاده شد. البته نشان داده شد که استراتژی درمانی به کار رفته با گروه های کنترل اختلاف آماری معنی داری نداشته است (۴۲).

 بنابراین در استراتژی های مبتنی بر نوع کلاسیک مهندسی تاندون، خواصی چون زیست سازگاری و تنواینتگریشن برجسته شدند چرا که تاندونی که به محل نقیصه تاندون، پیوند شده بود باید با لبه های باقی مانده از تاندون قبلی پیوند می خورد (تنواینتگریشن) و باید دارای خواص زیست سازگاری مطلوبی بود تا واکنش های آماسی و التهابی را در محل پیوند در کوتاه مدت و دراز مدت برنیانگیزد (۱). در استراتژی های مبتنی بر مفهوم نوین مهندسی تاندون خواص زیست تخریب پذیری، تنوکانداکشن، تنواینکورپوریشن و تنوژنز نیز به خواص یک داربست مهندسی شده اضافه شدند چرا که در این استراتژی ها بود که ساختار های داربست سه بعدی پیوند شده به محل نقیصه تاندون باید به تدریج جذب شوند (زیست تخریب پذیری)، بتوانند رشد طولی تاندون را در محل نقیصه تحریک نماید (تنوکانداکشن)، به موازاتی که در حین پروسه ترمیم تاندون تخریب می شوند، بقاقای آنها بتواند با بافت جدید رویش یافته توسط بدن که در محل نقیصه رشد می کند به طور ناگسستنی ای ادغام شود (تنواینکورپوریشن)، تفریق و تمایز سلول ها و تارچه ها و تارهای کلاژن را مانند ساختار تاندون طبیعی و دست نخورده موجب شود (تنواینداکشن) و در نهایت یک بافت تاندونی درون محل نقیصه ایجاد نماید که از منظر های گوناگون مورفولوژیک، بیومکانیکال و بیوشیمیایی مشابه با تاندون سالم باشد (تنوژنز) (۱). در این استراتژی های نوین است که مفهومی چون زیست فعالی شکل می گیرد با این مفهوم که سازه های سه بعدی مهندسی شده باید به گونه ای عمل نمایند که پس از پیوند به درون نقیصه تاندون، پروسه های زیستی مرتبط با ترمیم تاندون را به خوبی فعال نمایند با این هدف که در نهایت جذب شده و با تاندون طبیعی درون بدن بیمار جایگزین شوند. این ایده آل ترین استراتژی مهندسی بافت و پزشکی بازساختی تاندون در عصر حاضر ارزیابی می گردد و پژوهش هایی که خارج از این هدف حرکت نمایند، احتمالا نمی توانند در آینده این حوزه حرفی برای گفتن داشته باشند.

انتخاب داربست بر اساس نوع زیست مواد

به طور کلی داربست ها را می توان از مواد طبیعی مانند کلاژن، ابریشم، الاستین، ژلاتین، فیبرین و کیتوزان سنتز کرد؛ مکانیسم آماسی در این گروه از داربست ها قوی است ولی این مزیت را دارد که اکثریت این مواد سرعت تخریب پذیری مناسبی دارند و به جز ابریشم که مدت زمان زیادی برای جذب شدن لازم دارد، در بقیه موارد درصد بسیار کمی از این داربست ها درون نقیصه های تاندونی ترمیم یافته باقی می ماند (۲۱-۲۴). حالت دیگر استفاده از مواد سنتزی مانند پلی گلیکولیک اسید، پلی دیوکسانون، پلی کاپرولاکتون و پلی اورتران می باشد. در این حالت بر خلاف دسته اول که مکانیسم جذب بر اساس فاگوسیتوز و تحریک آماسی است، این مواد بر اساس مکانیسم هیدرولیز تجزیه شده و به آب و دی اکسید کربن تبدیل می شوند ولی مشکل زمانی مشخص می شود که حجم بالایی از این مواد در ساخت داربست ها استفاده شوند؛ در حدی که ممکن است از حالت تخریب پذیری به حالت غیر قابل تخریب تبدیل شده و تا سال ها در محل ضایعه باقی بمانند و طبیعی است که در این حالت پارگی از محل اتصال داربست به تاندون رخ می دهد که اصلا مطلوب نیست. ضمنا با توجه به اینکه مواد اخیر سرعت زیست تخریب پذیری کمتری دارند وجود فضاهای بسیار متخلخل و خالی درون داربست های سنتزی برای رویش بافت جدید بسیار مهم است و روند دیرتخریب پذیری آن ها ممکن است جلوی رویش مجدد تاندون جدید درون داربست را بگیرد و یا نهایتا تاندون همگونی ایجاد نشود (۲۵ و ۴۳). در حالت سوم، داربست را می توان از طریق ترکیب مواد طبیعی و سنتزی طراحی و تولید کرد که در این حالت ایده آل این است که درصد مواد طبیعی بالاتر از مواد سنتزی باشد چرا که مواد طبیعی به دلیل سرعت تخریب بالا اجازه رویش بافت جدید تاندون درون داربست را می دهد و می تواند روند های تنواینداکشن و تنوژنز را به خوبی تقویت نماید و مواد سنتزی نیست خواص بیومکانیک سازه مهندسی شده را که در کوتاه مدت مهم است فراهم نماید. به داربست هایی که با استفاده از دو یا چند زیست ماده در ساخت آن ها در قالب یک یا چند فاز ساخته می شوند، هیبرید می گویند (۲۴). موادی مانند ابریشم (سیلک) دارای خواص مکانیکی بالا ولی تقریبا بسیار دیرجذب بوده و زیست سازگاری کمی دارند. برای همین پژوهشگران برای بهبود خواص مکانیکی داربست از سیلک استفاده کرده اند ولی در فاز دوم، برای بهبود خواص زیست سازگاری؛ آن را با تارهای الکترواسپون شده کلاژن-پلی یورترال پوشش دادند و در شرایط برون تنی نشان دادند که این طراحی باعث بهبود زیست سازگاری شده بود (۴۴). همچنین داربست های کیتوزانی نیز توسعه داده شده است و نشان داده شد که وقتی سلول های پیش ساز تاندون را روی این داربست ها کاشتند، بیشتر از کنترل ها تمایز به تنوبلاست ها را بهبود دادند و وقتی داربست های کیتوزانی همراه با سلول به نقیصه های تاندون آشیل مدل حیوانی پیوند شد، تولید کلاژن نوع ۱ و نوع ۳، و تنومدولین افزایش یافت؛ امری که موجب شد تا خواص مورفولوژیک و بیومکانیک تاندون برتر از کنترل ها باشد (۴۵). 

مواد محرک ترمیم

استفاده از مواد محرک ترمیم در ترمیم تاندون های آسیب دیده سابقه ای به مراتب بیش از مهندسی بافت تاندون با استفاده از داربست های بافتی دارد (۵، ۶، ۹، ۱۳، ۴۶). با این حال به دلیل ارتباط تنگاتنگ این بخش با داربست های مهندسی شده، امروزه مواد محرک ترمیم به عنوان بخشی از مهندسی بافت و پزشکی بازساختی تاندون در نظر گرفته می شود. مواد محرک ترمیم با اهداف گوناگونی در استراتژی های مهندسی بافت و پزشکی بازساختی مورد استفاده قرار می گیرند: ۱- تحریک بدن به آغاز پروسه ترمیم موثر تاندون ۲- کمک به کاهش آماس و التهاب زیاد در پاسخ به ایمپلنت کردن سازه های مهندسی شده در محل ضایعه ۳- کنترل کردن سرعت جذب و یا تخریب داربست بافتی ۴- رهایش دارو به منظور کنترل عفونت و یا تحریک و تسریع ترمیم تاندون ۵- کمک به تمایز سلول های بنیادی کشت یافته یا تزریق شده درون یک داربست مهندسی شده ۶- کنترل فاز های ترمیم در راستای هدفمند کردن واکنش های آماسی، کلاژن سازی، آنژیوژنز و تفریق ساختار های بافتی در حین پروسه ترمیم تاندون ۷- کاهش چسبندگی های تاندون ۸- مرگ برنامه ریزی شده برخی از سلول ها و القای تزاید برخی دیگر از سلول های ترمیمی ۹- کمک به زنده مانی سلول های بنیادی و ۱۰ – کمک به افزایش زیست سازگاری یک سازه مهندسی شده تاندونی در محل نقیصه و البته اهدافی دیگر.

به صورت تئوریک، تاندون از سه بخش مهم تشکیل شده است. الف) ماتریکس بافتی که کلاژن ها بیشترین ملکول های تشکیل دهنده آن می باشند ب) مواد زیستی درون بافت که شامل فاکتور های رشد، فاکتور های التهابی و سایر فاکتور های تمایزی می باشد و ج) ساختار های سلولی (۱و۲). مواد محرک ترمیم در مهندسی بافت به طور کلاسیک شامل فاکتور های رشد بود ولی امروزه طیف وسیعی از مواد شیمیایی و دارویی و زیستی را شامل می شود: ۱-  فاکتور های رشد شامل فاکتور رشد فیبروبلاستی اسیدی و بازی، فاکتور رشد اندوتلیال و فاکتور رشد تمایز دهنده بتا و فاکتور رشد پلاکتی BB (Gonçalves و همکاران، ۲۰۱۸). ۲- گلیکوزآمینوگلیکان ها شامل اسید هیالورونیک، کندروئیتین سولفات، درماتان سولفات، هپارین سولفات و … ۳- متالوپروتئیناز های بافتی که انواع گوناگونی دارند ۴- اینترلوکین ها ۵- سیتوکین ها ۶- داروهای شیمیایی ۷- مواد زیستی مانند عسل، آلورا، ترانکرون (سم رطیل)، مایع سینویالی آسلولار، و … ۸- پپتید ها ۹- زیست مواد مانند نقره و نانونقره و … (۲).

تنومدولین یکی از مهم ترین مارکر های شناخته شده برای خط تمایزی تاندون می باشد و نبود آن باعث می شود تا بافت تاندون دچار تغییرات مورفولوژیک و مکانیکال گردد؛ امری که در بیماران منجر به پارگی تاندون می شود (۴۷). فاکتور های تمایزی زیادی جهت تنوژنز استفاده شده اند که مهم ترین آن ها شامل BMP-12, b-FGF, TGF-β۳, CTGF, IGF-1 و اسید آسکوربیک می باشد. نتایج مطالعات نشان داده است که TGF-β۳ مهم ترین القا کننده scleraxis، زودترین مارکر تاندونی که بیان می شود، می باشد. این فاکتور همزمان جلوی بیان دکورین (دیگر مارکر تنوژنز) را می گیرد. دکورین ولی توسط BMP-12, b-FGF و اسید آسکوربیک القا می شود (۴۸). مشخص شده است که TGF-β۱ می تواند تنومدولین و اسکلراکسیس را در سلول های بنیادی مزانشیمی در شرایط برون تنی افزایش دهد ولی رفتاری کاملا متفاوت در محیط درون تنی حیوانی دارد. فاکتور فوق از طریق افزایش متالوپروتئیناز های ۹ و ۱۳ فیبروز را تحریک می نماید ولی در تمایز سلول ها به تنوبلاست ها هیچ نقش مثبتی ندارد (۴۹). در عوض TGFβ۲ می تواند پرولیفراسیون سلولی را وابسته به Smad4 و پارامترهای تنوژنیک مانند ScxGFP و قطر تارچه های کلاژنی را مستقل از Smad4 در محیط های سه بعدی تحت کشش تحریک نماید (۳۸). همچنین ترکیب BMP-12  و BMP-14 با TGF- β۳ و VEGF در هر دو محیط دو و سه بعدی توانست باعث بهبود خواص تنوژنیک سلول های بنیادی مشتق از مغز استخوان گردد (۵۰).  در این میان نقش TGF- β۳ و BMP-12 مهم تر از بقیه ارزیابی شده است (۵۱). نقش فاکتور های رشد BMP12 و BMP13 در تمایز سلول های بنیادی جنینی به سلول های تاندون نشان داده شده است به طوری که این سلول ها در حضور دو فاکتور مورد اشاره، و اسید آسکوربیک به تنوبلاست ها تمایز می یابند (۵۲). اسید آسکوربیک در غلظت های پایین و در حضور هورمون T3 نیز می تواند باعث افزایش پرولیفراسیون تنوبلاست ها شده ولی در غلظت های بالا اثر سیتوتوکسیک بر آن ها دارد (۵۳).

PDGF-BB و BMP-2 که که روی داربست های پلی کاپرولاکتون-پلورونیک اف ۱۲۷ تثبیت شده بودند توانسته بودند ناحیه انتسیس (تاندون-غضروف-استخوان) را در مدل آوولژن تاندون پتلار رت ترمیم نمایند (۵۴). فاکتور رشد اندوتلیال عروقی نیز دارای اثرات تنوژنز می باشد که نشان داده شده است باعث افزایش پرولیفراسیون سلولی و بیان ژن های تاندون می شود (۵۵). نگارنده و همکاران نشان دادند که تزریق مکرر فاکتور رشد فیبروبلاستی بازی در مدل پارگی تجربی تاندون خم کننده سطحی خرگوش، توانسته بود به طور معنی داری باعث تفریق و تمایز تارچه های کلاژنی و تبدیل آن ها به تارهای کلاژن و نیز تمایز سلول های پیش ساز به تنوبلاست ها و بلوغ آن ها به تنوسیت ها، افزایش سنتز کلاژن نوع ۱ و در نهایت افزایش معنی دار خواص بیومکانیک تاندون نسبت به کنترل ها شود (۵، ۸ و ۱۳).

فاکتور های رشد/تمایزی یا growth/differentiation factors زیر خانواده TGF- β و شامل ۱۵ نوع می باشند. از ترکیب سلول های بنیادی مشتق از چربی و GDF-5 برای ترمیم آسیب تاندون آشیل در رت استفاده شده و نشان داده شده است که میزان بیان ژن های Dcn, Gdf5, Lox, Tgfb1, Mmp2, و Timp2  کاهش یافت و درنتیجه میزان هیدروکسی پرولین و کلاژن کاهش یافت که در ترمیم تاندون قابل قبول نیست (۵۶). در مقابل نشان داده شده است که GDF-7 در سلول های بنیادی که ژن تنومدولین را خیلی بیان می کنند، بیان می شود و می توان از این مارکر سطحی سلول برای جدا سازی سلول های بنیادی تنوژنیک استفاده کرد (۵۷). میوستاتین (GDF-8) یکی دیگر از تمایز دهنده های سلول های بنیادی مزانشیمی پلوریپوتنت می باشد که می تواند آن ها را به رده سلولی تنوبلاست ها تمایز دهد چون بیان ژن های اسکلراکسیس، کلاژن نوع ۱ و تنومدولین را افزایش می دهد. میوستاتین همچنین باعث بهبود رفتار های سلولی مانند مهاجرت و اتصال سلول های بنیادی شده است (۵۸).

پلاسمای غنی از پلاکت را از سانتریفیوژ خون محیطی تهیه می کنند. پس از سانتریفیوژ نمونه خون مخلوط شده با ماده ضد انعقاد، سه سطح ایجاد می شود که شامل پلاسمای فقیر از پلاکت، بافی کوت که شامل پلاسمای غنی از پلاکت و سلول های آماسی می باشد و سلول های قرمز خون که در پایین لوله قرار می گیرند. اگر بافی کوت را دوباره سانتریفیوژ نماییم، می توان پلاسمای غنی از پلاکت بدون گلبول سفید به دست آورد. پلاسمای غنی از پلاکت را می توان به صورت ژل نیز در آورد و در محل نقیصه های تاندونی استفاده کرد (تصویر ۲).

تصویر ۲: A) نحوه به دست آوردن پلاسمای غنی از پلاکت پس از دوبار سانتریفیوژ و ادغام آن با داربست به بعدی کلاژنی B-D) تصاویر میکروسکوپ الکترونی بازتابی از پلاکت ها و ماتریکس فیبرینی E) نمای میکروسکوپ نوری از گسترش تهیه شده از پلاسمای غنی از پلاکت

 اثرات مثبت پلاسمای غنی از پلاکت به گلبول های سفید آن و نیز فاکتور های رشد پلاکتی و گرانول های آلفای آن نسبت داده شده است. از پتچ های پلاکتی که با جنیپین کراس لینک شده اند در درمان چسبندگی های تاندون استفاده شده است و نشان داده شده است که این پتچ ها دارای خواص ضد باکتریال با قابلیت آزاد سازیbFGF  و PDGF-BB می باشند (۲۰، ۲۱، ۲۳، ۲۴). نشان داده شد که این پتچ ها از طریق فاکتور های رشدی که آزاد می کنند ژن های تنوژنیک SCX، TNC و COL1A1 را در سلول های تاندون انسانی تنظیم می کنند و بنابراین خاصیت تاندون زایی دارند (۵۹). در مطالعه ای نشان داده شد تفاوت آماری معنی داری بین گروهی که تاندون آسلولار گاوی را به عنوان پیوند دریافت داشته بود و گروه های دیگر که بدون تاندون و با پلاسمای غنی از پلاکت و یا به صورت ترکیبی درمان شده بود، در کیفیت بافت ترمیم یافته درون نقیصه تجربی تاندون در خرگوش مشاهده نشد (۶۰). نگارنده و همکاران، مدل جدیدی از پلاسمای غنی از پلاکت را در سطح جهان توسعه دادند. آن ها پلاسمای غنی از پلاکت را از خون محیطی گاو تخلیص کردند و پس از دوبار سانتریفیوژ پلاسمای غنی از پلاکت بدون گلبول سفید زنوژن را برای اولین بار معرفی نمودند. پلاسمای غنی از پلاکت به دست آمده سپس به صورت ژل پلاکتی درون داربست های هیبریدی کلاژنی میکرو-نانوساختار الکترواسپون ادغام شد و از سازه ترکیبی فوق، برای بازسازی نقیصه بزرگ تاندون آشیل در خرگوش استفاده شد. نشان داده شد که ژل پلاکتی به دست آمده در روش بالا به خوبی توانسته بود، فاکتور های PDGF-AA و PDGF-BB را در محیط  in vitro آزاد سازی نماید و نیز در محیط داخل بدن به طور کاملا معنی داری فرایند های التهابی و آماسی مرتبط با ماکروفاژ های M2 را بهبود بخشیده و در نتیجه باعث جذب راحت تر داربست کلاژنی حین پروسه ترمیم تاندون شود. همچنین نشان داده شد که ژل پلاکتی فوق توانسته بود باعث بهبود تنوژنز، تنواینداکشن، تنوکانداکشن، و تنواینکورپوریشن داربست کلاژنی در محل نقیصه شود به طوری که تاندون های تازه رویش یافته ای که جایگزین داربست هیبریدی شده بودند، دارای تفریق کلاژنی بهتر در فراساختار، و خواص بیومکانیک برتر و نزدیک به تاندون سالم پس از ۱۲۰ روز از پیوند بودند (۲۰، ۲۱، ۲۳، ۲۴). به نظر می رسد، نحوه ساخت پلاسمای غنی از پلاکت، میزان زنده مانی و عملکرد پلاکت ها، منبع پلاکت ها، غلظت آن ها در واحد میکرولیتر و فاکتور های دیگر، در اثربخشی این ترکیب حین پروسه ترمیم تاندون نقش حیاتی ایفا می نماید و ترکیبات پلاکتی مختلف اثربخشی متفاوتی دارند. از پلاسمای غنی از پلاکت در ترمیم ناحیه در حال گذار تاندون-استخوان (انتسیس) نیز استفاده شده است و نشان داده شده است که پلاسمای غنی از پلاکت در ترکیب با کارتوجنین (محرک غضروف سازی) باعث تحریک فرم گرفتن فیبروغضروف در ناحیه انتسیس می گردد که امری مفید برای اتصال تاندون به استخوان می باشد (۶۱).  

MMP ها نقش مهمی در فرایند تنوژنز دارند و بنابراین استفاده از آن ها به عنوان محرک ترمیم معقول به نظر می رسد. نشان داده شده است افزایش بیان PAI-1، مهار کننده فعالیت پروتئازی مانند MMP ها می باشد و اگر PAI-1 مهار شود چسبندگی های تاندون مهار می شود. رها سازی siRNA هایی که Serpine1 را هدف گرفته اند از طریق نانوذرات در تاندون های فلکسور باعث افزایش فعالیت MMP ها شد (۶۲).

ساختار های سلولی

در استراتژی های مبتنی بر مهندسی بافت و پزشکی بازساختی علی الخصوص در مفهوم جدید آن، این ساختار های سلولی هستند که مسئول تولید ماتریکس جدید و مواد محرک ترمیم می باشند (۲). اگرچه از داربست ها برای محیطی موقت جهت پیوند سلول ها به داخل نقیصه های تاندون، و نیز از مواد محرک ترمیم جهت تمایز سلول های بنیادی پیش و پس از پیوند به بدن استفاده شده است؛ این ساختار های سلولی هستند که در دراز مدت مسئول توسعه شبکه بافتی مانند ملکول های کلاژن و گلیکوزآمینوگلیکان ها و فاکتور های محرک و کنترل کننده ترمیم مانند متالوپروتئیناز های بافتی و فاکتور های رشد می باشند (۲). بنابراین نقش ساختار های سلولی مهم است. به طور کلاسیک، سلول های بنیادی به خاطر خواص تقسیم و تمایز به تنوبلاست ها و سلول های اندوتلیال بیشتر از سلول های بالغ مورد توجه بوده اند و در این میان سلول های مزانشیمال مشتق از مغز استخوان و چربی بیشترین فراوانی در استفاده را داشته اند (۲). اثرات مثبت سلول های بنیادی مشتق از چربی در افزایش مقاومت مکانیکی تاندون خم کننده سطحی خرگوش نشان داده شده است (۶۳).

کشت همزمان سلول های بنیادی با سلول های تاندون مزیت های زیادی دارد. نشان داده شده است وقتی سلول های بنیادی مشتق از چربی را با سلول های تاندون کشت می دهند، سلول های تاندون باعث کشیده شدن سلول های بنیادی می شوند و همچنین ژن های کلاژن نوع ۱ و تناسین C و نیز برخی از ژن های remodel کننده ماتریکس خارج سلولی مانند MMP1-3 و TIMP1 نیز بیان می شوند (۶۴). در یک کشت توامان سلول های بنیادی مزانشیمی مشتق از چربی و تنوسیت ها پرولیفراسیون و تولید کلاژن نوع ۱ سینرژیستیکی را تجربه کردند و سلول های بنیادی رفتار های تنوسیت ها مانند مهاجرت و اتصال را تحریک کرده بود (۶۵). همچنین نشان داده شده است که سلول های بنیادی مشتق از مغز استخوان که روی داربست های پلی اتیلن ترفتالات کاشته شده بودند، پس از پیوند به داخل نقیصه تاندون آشیل خرگوش باعث بهبود روند ترمیم در مقایسه کنترل شده بودند (۶۶).

اما نحوه انتخاب سلول های بنیادی نیز مهم است. مثلا در همین بافت چربی نشان داده شده است که سلول هایی که برای تنومدولین مثبت هستند بیشتر از سایر سلول های بنیادی بافت چربی دارای خاصیت تنوژنز هستند و این سلول ها را می توان با فناوری الکترومغناطیسی جداسازی کرد. سایر مارکر های تاندونی شامل اسکلراکسیس، تناسین C و دکورین می باشد (۶۷).

روش های مختلفی در استفاده از سلول های بنیادی مطرح است. در پارگی های تاندون که دو لبه تاندون با استفاده از بخیه به یکدیگر دوخته می شوند، تزریق سلول های بنیادی به داخل ضایعه از قدیمی ترین و رایج ترین روش ها بوده است. لکن در این روش ممکن است سلول های تزریق شده به فضاهای دیگری خارج از محل آسیب دیده تاندون مهاجرت نموده، بمیرند و در صورت زنده مانی به سلول هایی غیر از تنوبلاست ها تمایز یابند و یا چسبندگی های اطراف تاندون را از طریق تقویت مکانیسم extrinsic ترمیم تاندون، تشدید نمایند (۶۸). در روش دیگر، سلول های بنیادی را در داخل هیدروژل ها که آن ها نیز نوعی داربست سه بعدی می باشند، محصور می کنند و همراه با هیدروژل در محل ضایعه تزریق می کنند که اشکال این روش نیز عدم پایبندی سلول های بنیادی به حضور در محل ضایعه به دلیل کاهش وجود کنام های سلولی در داخل هیدروژل و جذب سریع آن هاست. البته اخیرا هیدروژل های حساس به حرارتی ساخته شده است که پس از تزریق جامد شده و مقاومت تخریبی نسبتا بالایی دارد. ضمن اینکه با استفاده از مواد کلاژنی و یا مواد مشابه کنام های سلولی درون این هیدروژل ها را تقویت کرده اند (۴۱). کاشت سلول های بنیادی به سطوح یک سازه سه بعدی از دیگر روش های مهندسی سلول های بنیادی جهت ترمیم آسیب های تاندونی است. اشکال این روش نیز تعداد کم سلول هایی است که می تواند در سطح یک داربست کاشت. نکته دیگر اینکه این سلول ها لزوما پس از پیوند به داخل داربست مهاجرت نمی کنند. روش جدید تر و البته گران تر نیز کاشت سلول های بنیادی بر روی داربست ها و سپس کشت آن ها در شرایط آزمایشگاهی می باشد که اشکال این روش پیر شدن سلول های بنیادی، گران بودن هزینه تولید، و عدم تمایز همه سلول های کشت یافته به تنوبلاست ها می باشد و بنابراین ممکن است پس از پیوند یک بافت ناهمگون درون مرکز ضایعه شکل بگیرد که به دلیل تفاوت در خواص بیومکانیک می تواند حساسیت به پارگی را در زمان وزن گذاری بیمار روی تاندون در حال ترمیم افزایش دهد. یکی از روش های دیگر پیوند سازه های سه بعدی واجد کنام های سلولی به داخل نقیصه های تاندون می باشد که در این روش، ممکن است سلول های بنیادی از طریق عروق محیطی بدن به طور سیستمیک تزریق شود که پس از گردش عمومی در خون به محل کنام درون داربست نفوذ می نمایند. در روشی که سلول های بنیادی به داخل یک داربست برده می شوند و مجموعه داربست سلول به داخل محل ضایعه ایمپلنت می شود، سلول های بنیادی در زمانی قرار است که پروسه پرولیفراسیون و تمایز سلولی را بهبود بخشند که چند روزی پس از کاشت داربست به روش جراحی، فاز آماسی و التهابی ترمیم آغاز می شود و بسیاری از این سلول ها به دلیل شرایط هیپوکسیک، اسیدیته و سلول های آماسی به خصوص ماکروفاژ ها و نوتروفیل ها ممکن است بمیرند. بنابراین تعداد بسیار زیادی از سلول های بنیادی به مجرد انتقال به درون بدن از طریق داربست از بین می روند و تعداد کم سلول های بنیادی باقی مانده هم نمی توانند تغییرات معنی داری در راستای تسریع ترمیم ایجاد نمایند. اما در روشی که کنام سلولی در داخل داربست ایجاد شده است؛ پس از پیوند داربست سه بعدی به داخل نقیصه تاندون، می توان تزریق سلول های بنیادی را به مدت زمانی پس از انتهای فاز حاد آماسی تاندون موکول کرد و در زمانی سلول های بنیادی را تزریق کرد که تعداد سلول های آماسی به حداقل رسیده است، متالوپروتئیناز ها، اینترلوکین ها، سیتوکین ها و فاکتور های رشد در سطح به خصوصی هستند که نمایانگر مرحله تنوپلازی یا پرولیفراسیون بافتی می باشد (۶۹-۷۳). اما استراتژی های استفاده از سلول های بنیادی روز به روز در حال پیشرفت می باشد. در کشور ما، بیشتر به استفاده از سلول های بنیادی مزانشیمی اکتفا شده است. حال آنکه در کشورهای پیشرفته طیف وسیعی از سلول های بنیادی در مهندسی بافت تاندون مورد استفاده قرار گرفته است که به عنوان مثال می توان به استفاده از سلول های پیش تمایز یافته به فیبروبلاست ها، سلول های فیبروبلاستی تمایز یافته، سلول های بنیادی با منشا نوزادی و جنینی نیز اشاره کرد. شاید یک تفاوت در رویکرد کشور ما در انتخاب منابع سهل الوصول تر سلول های بنیادی، هزینه های بالای تخلیص و کشت سلول های بنیادی و فاصله فناوری با کشور های صاحب سبک باشد (۷۴).  

در سلول درمانی توسعه کنام های سلولی از اهمیت ویژه ای برخوردار است به طوریکه جدیدترین استراتژی های سلول محور به سمتی رفته است که در آن از سلول های بدن میزبان به طور غیر مستقیم برای درمان ضایعات بافتی تاندون استفاده شده است (۲). در این روش برخلاف روش های دیگر، هیچ سلولی به داخل محل ضایعه فرستاده نمی شود بلکه کنام های سلولی زیادی درون داربست ها ساخته می شود و فرمولاسیونی در انتخاب زیست مواد ها و مواد محرک ترمیم استفاده می شود که داربست پس از پیوند به داخل محل ضایعه این توانایی را دارد که سلول های بنیادی در داخل بدن میزبان را به داخل محل ضایعه فراخوانی نموده و روند ترمیم را تسریع نماید. مطالعات نشان داده اند که استفاده از این روش نقش مهمی در میزان زنده مانی سلول های بنیادی در محل ضایعه حین پروسه ترمیم تاندون دارد. بایگلایکان ها یکی از اجزای مهم کنام سلول های بنیادی مشتق از تاندون می باشند و در تنوژنز نقش اساسی دارند. تنها ۵۰ نانوگرم از بایگلیکان های محلول نشان داده شده است که می تواند مارکر های استئوژنیک و کندروژنیک مانند SOX9، ACN و RUNX2 را مهار نماید و از طریق BMP7/Smad1/5/8 pathway  (تصویر ۳) تنوژنز را بهبود بخشد (۷۳).

Image result for BMP7/Smad1/5/8 pathway

تصویر ۳: مکانیسم ضد فیبروتیک مسیر سیگنالینگ BMP-7/Smad. BMP-7 و TGF-β فسفریلاسیون R-Smads را تحریک می کنند که از طریق Smad4 باعث رفت و آمد به هسته می شود که این امر به منظور رونویسی ژن انجام می گردد. فسفریلاسیون Smad 1/5/8 که توسط BMP-7 انجام می گیرد باعث رونویسی از ژن های هدفی می گردد که اثرات ضد فیبروژنیک دارند که توسط سیگنال TGF-β-Smad2/3 القا می گردد.

BMP7, bone morphogenic protein; TGF-β, transforming growth factor- β۱; ECM, extracellular matrix proteins; MMP, matrix metalloproteinase; PAI-1, plasminogen activator inhibitor-1.

یکی از استراتژی ها در سلول درمانی، اثرات پاراکرین سلول می باشد. در این روش ترشحات سلول های بنیادی را از محیط کشت تخلیص می کنند و در ناحیه ضایعه دیده از آن ها استفاده می کنند که این امر تنوژنز را بهبود می بخشد. در اثر پاراکرین، نیازی به حضور سلول های بنیادی نیست. نشان داده شده است که ترشحات (secretome) سلول های بنیادی مزانشیمی باعث افزایش زنده مانی و افزایش دانسیته سلول های تاندون در واحد سطح می شود. همچنین نشان داده شد که وقتی این سلول ها را داخل داربست الکترواسپون کراتینی قرار دادند و در محل ضایعه تجربی تاندون روتیتورکاف در رت پیوند کردند، گروه درمان شده در مقایسه با کنترل دارای تاندون ترمیم یافته برتری از منظر بیومکانیک و موروفولوژیک بود (۶۹). نشان داده شده است که فاکتور مشتق از سلول های استرومال (SDF-1α) می تواند روند ترمیم تاندون را از طریق فراخوانی سلول های داخل بدنی به محل ضایعه بهبود بخشد. در مطالعه  ای، SDF-1α به گیرنده های کلاژنی متصل شده و به ملکول های کلاژن که به صورت داربست ساخته شده بودند متصل گشتند. نشان داده شد که SDF-1α باعث افزایش مهاجرت سلولی شد و در مدل حیوانی توانست فراخوانی فیبروبلاست های مثبت از نظر CXCR4 و رسوب تناسین C را ۷ روز پس از کاشتن در محل ضایعه افزایش دهد. ۴ و ۱۲ هفته بعد SDF-1α توانسته بود تا باعث افزایش سنتز کلاژن نوع ۱، افزایش قطر تارچه های کلاژن و خواص مکانیکال تاندون ترمیم یافته نسبت به کنترل ها شود (۷۵).

رهیافت های دیگری نیز استفاده شده است که در آن لزوما از سلول های بنیادی مزانشیمی و یا فیبروبلاست ها و تنوبلاست های نیمه تمایز یافته و یا با تمایز کامل استفاده نشده است. در استراتژی اخیر از سلول های ایمنی مانند ماکروفاژ ها جهت مدیریت فاز آماسی و در نتیجه تسریع ترمیم استفاده شده است. نگارنده و همکاران و دیگران، پیشتر نشان دادیم که ترمیم موفق و هدفمند تاندون نیازمند ایجاد پاسخ التهابی و آماسی ولی کنترل شده می باشد و در این میان ماکروفاژ ها به دلیل عمر طولانی تر و عملکرد مهم تری که نسبت به نوتروفیل ها و سایر سلول های آماسی دارند، از اهمیت ویژه ای برخوردار هستند (۱ و ۷۶). نشان داده شد که لنفوسیت های T-helper نوع ۱، ماکروفاژ های M1 را فعال می کنند، امری که منجر به پاسخ های آماسی شدیدی می گردد و بالعکس، لنفوسیت های T-helper نوع ۲، ماکروفاژ های M2 را فعال می کنند، امری که منجر به پاسخ های آماسی remodel محور در روند ترمیم تاندون می شود. نشان داده شده است که ترمیم تاندون در تاندون های بالغ از طریق اسکار و در تاندون های جنینی بدون تولید اسکار انجام می شود. این اختلاف به دلیل عدم توازن عملکرد های آنابولیک و کاتابولیک حین ترمیم تاندون ارزیابی شد. نشان داده شد که در حضور اینترلوکین ۱ بتا (فاکتور التهابی تحت تاثیر فرایند ماکروفاژ های M1)، تاندون های بالغ میزان زیادی واسطه های التهابی آزاد کردند که توازن فوق را برهم زد و شدت پاسخ ۵/۱۲ برابر تاندون های جنینی بود (۷۷). نگارنده و همکاران، پیشتر نشان دادند، که استفاده از داربست های کلاژنی در ترکیب با ژل پلاکتی می تواند به طور معنی داری پاسخ های M2 را بیشتر از اتوگرافت فعال کند و باعث جلوگیری از جذب سریع داربست شود. این یافته از این جهت مهم است، چراکه واکنش های آماسی شدید منجر به دفع پیوند از طریق جذب سریع داربست شده و تولید اسکار را تحریک می کند در حالی که واکنش های آماسی remodeling که از طریق ماکروفاژ های M2 رخ می دهد باعث می شود تا داربست ایمپلنت شده در روند ترمیم تاندون مشارکت کرده، به تدریج جذب شود و این جذب تدریجی همزمان با رویش تاندون جدید در فضاهای خالی آن باشد. افزون بر این این پاسخ آماسی اخیر، باعث می شود تا تنواینکورپوریشن به خوبی در بقایای جذب نشده داربست رخ دهد (۲۳ و ۲۴).

اخیرا پژوهشگران نشان داده اند که سلول های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان می توانند باعث قطبیت ماکروفاژ ها به ایمونوفنوتیپ M2 از طریق مکانیسم پورکین شوند. ماکروفاژ های نوع M2 دارای خاصیت کاهش دهنده التهاب بوده و در حضور آنها تنوژنز بهتری اتفاق می افتد (۷۲). به عبارت دیگر، سلول های بنیادی مزانشیمی ماکروفاژ ها را دوباره برنامه ریزی می کنند تا از حالت M1 که خواص مضر التهابی دارد به حالت M2 که برای ترمیم مفید است، تغییر فاز دهند. در مطالعه ای در مدل حیوانی نشان داده شد که اگر سلول های بنیادی در شرایط پریکاندیشنینگ قرار گیرند، می توانند اثرات ضدالتهابی بهتری را در راستای اصول فوق از خود نشان دهند (۷۸). در مطالعه دیگری فاکتور رشد بافت پیوندی در داخل تاندون پاتلار رت رهاسازی شد و نشان داده شد که فاکتور رشد مورد اشاره تعداد سلول های پروژنیتور تاندون را درون محل ضایعه افزایش داد در حالی که ماکروفاژ های نوع یک را کاهش داد و اینترلوکین ضد التهابی نوع ۱۰ را دو روز پس از جراحی افزایش داد. در واقع این فاکتور رشد سلول های بنیادی تاندون را به محل ضایعه فراخوانی کرده بود، و اینترلوکین ۱۰ توسط همین سلول ها افزایش یافته بود. یک هفته بعد، علاوه بر اینکه بیان ژن اینترلوکین ۱۰ افزایش یافته بود، اینترلوکین ۶ کاهش یافت و بیان MMP-3 نیز افزایش نشان می داد که همراه با نظم تارهای کلاژن درون محل ضایعه بود. یک هفته بعد TIMP-3 افزایش یافت که همه این وقایع توسط مبدل سیگنال JNK و فعال کننده سیگنال رونویسی نوع ۳ کنترل می شود. همه این وقایع نشان داد که فاکتور رشد بافت پیوندی از طریق خواص ضد التهابی خود بر ماکروفاژها ترمیم تاندون را تسریع می نماید (۷۹). در مطالعه دیگری سلول های بنیادی مزانشیمی مشتق از چربی با فاکتور رشد بافت پیوندی (CTGF) در روند ترمیم تاندون خم کننده سگ بررسی شد و نشان داده شد که فاکتور رشد با یا بدون سلول توانسته بود آماس و التهاب ناشی از بیان IL-1B , IL-6 و MMP3 و MMP-13 را کاهش دهد و همزمان باعث افزایش بیان ژن IL-4 که دارای خواص ضدالتهابی است بگردد (۸۰). در یک مطالعه حیوانی دیگر در مدل تاندون داخل سینویالی سگ نشان داده شد که استفاده همزمان از سلول های بنیادی چربی و BMP-12 بر روی سطوح تاندون های فلکسور بخیه شده، نه تنها هیچ اثری بر تحریک چسبندگی تاندون نداشته است بلکه، ماکروفاژ های M2 را از طریق افزایش اینترلوکین ۴ و متالوپروتئیناز ۱۲ افزایش داد و فاز پرولیفراسیون روند ترمیم تاندون را بهبود بخشید (۸۱). همانطور که پیشتر اشاره شد، چسبندگی های تاندون یکی از محدودیت های ترمیم است و نشان داده شده است که موش هایی که ماکروفاژ کمتری در بدنشان داشته اند چسبندگی های تاندونی کمتری از موش های سالم نشان دادند. نشان داده شد که ماکروفاژ های مغز استخوان miR-21-5p اگزوزومالی را از خود ترشح می کنند که مستقیما Smad7 را فعال می کند؛ امری که منجر به فیبروژنز در سلول های تاندون می گردد (۸۲).

منبع سلول های بنیادی مورد استفاده در تحقیقات حیوانی و دامپزشکی نیز محل چالش است. اگرچه در انسان احتمالا به دلیل بیماری های خطرناک قابل انتقال استفاده از منابع دیگر سلولی به خصوص نوع آلوژنیک آن با چالش مواجه است؛ به نظر می رسد این مهم در دامپزشکی کمتر مورد چالش واقع شده است. در مطالعه ای در مدل نقیصه تجربی تاندون آشیل خرگوش از سه رهیافت برای مهندسی تاندون استفاده شد که شامل استفاده از داربست بدون سلول، و داربست هایی بود که روی آن ها سلول های اتولوگ و آلولوگ خرگوش کاشته شده بود. بعد از ۷ و ۱۳ ماه از پیوند داربست ها درون نقیصه، در هر سه گروه، تاندون به خوبی رویش یافته بود ولی در گروه اتولوگ مقداری کیفیت بافت تاندون برتر بود (از منظر تجزیه داربست و تارچه های کلاژن قطور تری که گروه اتولوگ نشان می داد) ولی بین گروه ها از منظر بیومکانیکی تفاوت آماری معنی داری مشاهده نشد که نشان می دهد منبع آلولوگ نیز همانند اتولوگ در مهندسی بافت تاندون می تواند دارای کاربرد باشد (۸۳). همچنین در مطالعه دیگری نشان داده شد که وقتی سلول های بنیادی تاندون را بر روی داربست مشتق از تاندون خوک کشت داده و به نقیصه تاندون آشیل در رت پیوند کردند، نسبت به زمانی که به جای سلول های بنیادی تاندون از سلول های بنیادی جنینی استفاده کردند، روند ترمیم برتری را شاهد هستیم (۸۴).

آینده سلول درمانی به سمت سلول درمانی ترکیبی در حال گذار است. در این استراتژی نوین، از ترکیبی از سلول های بنیادی عروق ساز در کنار سلول های بنیادی مزانشیمی پیش تمایز یافته به تنوبلاست ها و البته ماکروفاژ ها و سایر سلول ها استفاده می گردد با این هدف که حداکثر شبیه سازی با بافت در حال ترمیم تاندون به وجود آید؛ روشی که البته گران به نظر می رسد و کیفیت نتایج آن فعلا در هاله ای از ابهام است.

ژن درمانی

تخلیص بسیاری از ترکیبات محرک ترمیم به خصوص فاکتور های رشد گران است و عملا در کلینیک کاربرد وسیعی نیافته است. یک راه جایگزین مهندسی سلولی از طریق ژن درمانی است. می توان با دستکاری ژنتیکی سلول های بنیادی و انتقال ژن های مفید در پروسه تنوژنز، تولید مارکر های تنوژنیک را به طور غیر مستقیم افزایش داد. افزایشی زایا و پایا که نیاز به تزریقات مکرر فاکتور های رشد در حین پروسه ترمیم را به حداقل می رساند. اخیرا نشان داده شده است که فاکتور رونویسی Fos در تاندون های جنینی و نوزادی به مراتب بیشتر از تاندون های بالغ و پیر بیان می شود به طوریکه در مدل تجربی آسیب تاندون در رت، سلول های مهندسی شده که این فاکتور رونویسی را بیشتر بیان می کردند و به محل ضایعه پیوند شدند و نشان داده شد که این سلول ها باعث بهبود روند ترمیم در مقایسه با کنترل ها شدند (۷۰). اخیرا نوعی ملکول با عنوان لنگر های اختصاصی کلاژن مصنوعی ساخته شده است که سلول ها را در حین ترمیم تاندون قادر می سازد تا فاکتور رشد انسولینی (IGF-1) را در محل هدف یا همان ضایعه رهاسازی نمایند. در پژوهشی با دستکاری ژنتیکی سلول هایی که ژن لنگر اختصاصی کلاژن را بیان می کنند، سلول ها را وادار به تولید IGF-1 کردند و نشان دادند که این سلول ها با آزاد سازی فاکتور رشد انسولینی می توانند ماتریکسی غنی از کلاژن ایجاد نمایند (۸۵).

پلی تراپی (درمان چند ضلعی)

استفاده همزمان از داربست ها، مواد محرک ترمیم و سلول های بنیادی مانند یک ارکستر سمفونی می باشد که می تواند تار و پود ترمیم تاندون را به زیباترین شکل به حرکت و نواختن در بیاورد (۸۶). در مطالعه ای ناحیه اتصال تاندون استخوان در ناحیه آشیل کالکانئال رت برداشته شد، و پس از آسلولاریزاسیون، با پلاسمای غنی از پلاکت ترکیب شد و تحت کشت با سلول های بنیادی چربی قرار گرفت. نتایج نشان از اثر سینرژیستی استفاده از هر سه استراتژی داربست، مواد محرک ترمیم و سلول در روند ترمیم انتسیس داشت (۸۷). در یک مطالعه کوهورت انسانی اثرات مفید استفاده توامان چسب فیبرینی همراه با سلول های بنیادی مزانشیمی مشتتق از چربی در ترمیم ضایعات تاندون روتیتورکاف پس از ۲۸ ماه دنبال کردن بیماران نشان داده شده است (۸۸). اخیرا نوع جدیدی از داربست های چندفازی توسعه یافته است به این صورت که در این ساختار سه بعدی، از تارهای الاستیک هیالورونیت همراه با سلول های بنیادی مغز استخوان و ریزحامل هایی از جنس پلی لاکتیک کو گلیکولیک اسید که حامل فاکتور رشد تمایزی ۵ انسانی می باشد استفاده شده است و نشان داده شد که این ساختار مارکر های تنوژنیک شامل کلاژن نوع ۱ و ۳، دکورین، اسکلراکسیس و تناسین C را بیشتر از کنترل ها بیان می کند (۸۹). در مطالعه دیگری نشان داده شد که سلول های میکروسکولار اندوتلیالی مشتق از چربی وقتی با سلول های بنیادی مزانشیمی بر روی داربست های متخلخل کشت همزمان داده شوند می توانند در اطراف رگ فمورال رت تبدیل به یک گرافت وسکولار شده و این قابلیت را پیدا کنند که از آنها برای ترمیم نقیصه های تاندون استفاده شود (۹۰). همچنین از چسب فیبرینی مشتق از زهر مار در ترکیب با سلول های بنیادی مزانشیمی مشتق از چربی در ترمیم تجربی آسیب تاندونی در مدل حیوانی استفاده شده است و نتایج مثبتی از کیفیت تاندون ترمیم یافته گزارش شده است (۹۱).

مهم ترین فناوری های مورد استفاده در مهندسی بافت

الکترواسپینینگ

یکی از مهم ترین مولفه ها در مهندسی بافت تاندون، فناوری هایی است که به تدریج توسعه می یابند (۹۲).  فناوری الکترواسپینینگ توسط دیگران و نویسنده این مقاله در سال های گذشته توسعه یافته است با این هدف که از این فناوری که پیشتر در صنایع نساجی کاربرد داشته است برای سنتز الیاف در مقیاس های مختلف از نانو تا میکرو ساختار استفاده شود و علاوه بر این تارهای ساخته شده که تار و پود یک داربست مهندسی شده را تشکیل می دهند، با نظم خاصی در زمان سنتز در کنار یکدیگر قرار گیرند (۹۳). در مطالعه ای از جوهر زیستی آلجینات و ژلاتین متاکریلول به همراه سلول های بنیادی مشتق از مغز استخوان جهت ساخت داربست های اسپین شده استفاده شد و سلول های بنیادی با فاکتور BMP-12 به تنوبلاست تمایز یافتند. الیاف این داربست در محیط کشت تحت نیروهای مکانیکی منظم شدند و نشان داده شد که نظم تارهای داربست فوق، باعث بهبود تمایز سلول های تنوبلاستی و افزایش بیان ژن های کلاژن نوع ۱ و ۳ شده بود (۹۴). در مطالعه دیگری از نانوالیاف الکترواسپون پلی کاپرولاکتون – پلی گلیکولیک اسید برای بررسی اثر نظم تارهای داربست بر رفتار سلول های بنیادی چربی و تاندون استفاده شد و نشان داده شد که در حضور نظم تارهای داربست، مارکر های تنوژنیک افزایش معنی داری پیدا می کنند (۹۵).  یکی از راه های منظم کردن تارها علاوه بر الکترواسپین کردن، وارد آوردن نیروهای مکانیکی بر داربست هایی است که روند پلی مریزاسیون آن ها شروع شده است. اخیرا سیستم های سه بعدی کشت سلول روی محفظه های سیلیکونی و اسفنج های کلاژنی توسعه یافته اند که می توانند کشش مکانیکی سایکلیک و تحریکات بیوشیمیایی را به سلول های بنیادی مزانشیمال مشتق از مغز استخوان وارد نمایند. در این مطالعه، نیروهای مکانیکی همراه با TGF-β۱ نه تنها زنده مانی سلول را افزایش دادند، بلکه با تاثیر سینرژیستیک باعث افزایش تمایز آن ها به تنوسیت ها شدند (۹۶). نشان داده شده است که نیروهای یک طرفه به تاندون باعث القای فسفریلاسیون pAKT می شود و نیروهای دوطرفه باعث القای pERK. همچنین نیروهای یک طرفه از طریق مهار مسیر سیگنالینگ PI3K/AKT باعث القای تنوژنز می شود (۹۷).

اثر نظم تارهای یک داربست در بهبود کیفیت ترمیم تاندون به خصوص خاصیت تنوژنز آن به خوبی در مدل حیوانی نشان داده شده است (۹۸). از کیتوزان و پلی اتیلن اکساید نیز برای ساختن تارهای الکترواسپون شده منظم برای مهندسی بافت تاندون استفاده شده است (۹۹). نشان داده شده است که بی نظمی تارهای یک داربست ارتباط معنی داری با تحریک واسطه های التهابی و در نتیجه واکنش های دژنراتیو و ترمیم ضعیف تاندون دارد. در مطالعه ای اثر نظم و بی نظمی پلی کاپرولاکتون های الکترواسپون شده بر سلول های بنیادی بررسی شد و نشان داده شد که اثر نظم در داربست و سلول های کاشته شده بر روی آن باعث تشویق سلول ها به تولید ماتریکس تاندونی و کاهش واکنش های آماسی می شود (۱۰۰).

نگارنده و همکاران نشان دادیم که زمانی که یک داربست دو بعدی از الیاف نانوساختار را کنار ملکول های کلاژن قرار می دهیم می توان داربست های سه بعدی را درون یک هیدروژل خام کلاژنی به گونه ای ایجاد کرد که نانوالیاف اسپین شده به روش فوق، به عنوان هادی برای پلیمریزاسیون ملکول های کلاژن درون هیدروژل عمل نمایند؛ امری که منجر به ساخت داربستی سه بعدی با الیاف نانو و میکروساختار منظم شد. در مطالعه فاز in vitro نشان دادیم که این الیاف منظم شده تمایز سلول های بنیادی مزانشیمی به فیبروبلاست ها را تحریک کردند و در فاز in vivo تشکیل ملکول های کلاژن درون بدن را در راستای ساختار خود تسهیل و هدایت نمودند و از این طریق باعث کاهش چسبندگی بافت ترمیم یافته تاندون به بافت های اطراف شدند (۱، ۱۹، ۲۲). اگرچه، مثال فوق، یک نوآوری در دنیای علم امروز بوده است، ولی تاکید می گردد که داربست های ساخته شده از فناوری الکترواسپینینگ بسیار گران قیمت می باشند و نمی توان از آن ها برای ساخت حجم های بالا استفاده کرد و بیشترین کاربرد آن ها جهت ساخت داربست های دو بعدی است که به عنوان غلاف مهندسی شده تاندون (جهت کاهش میل تاندون ترمیم یافته به چسبندگی به بافت های اطراف) می باشد. اخیرا داربست میکروفیبریلار جدیدی بر پایه فناوری فوق در ابعاد قابل استفاده جهت ترمیم ضایعات تاندون به روش جراحی در انسان ساخته شده است (۱۰۱).

کراس لینکینگ

کراس لینکینگ یکی دیگر از مهم ترین فناوری های مورد استفاده در مهندسی تاندون به خصوص در مرحله ساخت یک داربست می باشد (۱). در این روش با استفاده از فعل و انفعالات شیمیایی و ایجاد پیوند های متقاطع بین ملکول های یک سازه مهندسی شده، می توان مدت زمان زیست تخریب پذیری را افزایش داد، به سازه هایی که حالت هیدروژلی دارند فرم جامد داد، خواص بیومکانیکی یک داربست را بهبود داد، و نحوه تخریب یک سازه درون بدن را طراحی و قابل پیش بینی نمود (۲۲). همچنین از کراس لینکینگ استفاده می شود تا داربست های مهندسی شده تاندونی با حفرات قابل پیش بینی و مناسب جهت رشد سلول و بافت ساخته شود (۱۹). برای این کار از این فناوری در ترکیب با فناوری خشک کن انجمادی استفاده می شود. از موثر ترین و قدیمی ترین موادی که می توان با آن ها عملیات کراس لینکینگ را انجام داد، می توان به گلوتر آلدهید اشاره کرد که یکی از قوی ترین کراس لینکر های شناخته شده در مهندسی بافت تاندون می باشد (۱). گلوترآلدهید به طرز شگفت آوری قابلیت ایجاد کردن پیوند های متقاطع بین ملکول های زیستی را دارد، مقرون به صرفه است و البته در دسترس بسیاری قرار دارد (۱). با این حال در شرایط in vitro نشان داده شده است که استفاده از گلوترآلدهید، زیست سازگاری یک سازه را در ارتباط با سلول های بنیادی کشت یافته در و بر آن کاهش می دهد؛ ولی تاکنون مطالعه ای که اثر زیست سازگاری گلوترآلدهید را در مقایسه با سایر روش های کراس لینکینگ نشان بدهد، در حوزه مهندسی تاندون، انجام نشده است (۲۵). جنیپین خواص زیست سازگاری بهتری در مقایسه با گلوترآلدهید در شرایط  in vitro نشان داده است ولی مشکل عمده عدم دسترسی خوب و قیمت بالای این ماده به منظور کراس لینکینگ سازه های مهندسی شده تاندون می باشد (۲۵). روش دیگری که نگارنده و همکاران برای اولین بار در سطح جهان در مهندسی بافت تاندون توسعه دادند، استفاده از روش تلفیقی ریبوفلائین – اشعه ماورای بنفش نوع A بود که نشان دادیم با استفاده از این روش می توان خواص بیومکانیک داربست را به طور کاملا معنی داری بهبود داد بدون اینکه بر زیست سازگاری داربست اثر منفی داشته باشد (۱، ۱۹ و ۲۲). روش حرارت دادن و استفاده از گاما نیز به دلیل تخریب ماتریکس داربست و خواص بیومکانیکی ضعیفی که دارد در مهندسی بافت تاندون توسعه نیافته است. اخیرا از روش آنزیمی EDC/NHS برای کراس لینک کردن داربست های کلاژن-هیالورونان استفاده شده است و نشان داده شده است در این روش ساختار های کلاژنی داربست کمتر تحت تاثیر تخریب قرار می گیرند و بنابراین نسبت به روش گاما ارجح است (۱۰۲).

خشک کن تصعیدی

خشک کن تصعیدی یا فریز درایینگ یکی دیگر از فناوری های مهم در مهندسی بافت می باشد و با استفاده از این فناوری می توان حفراتی درون داربست در اندازه های میکرو و نانومتری ایجاد کرد. استفاده از این روش در مهندسی بافت استخوان و غضروف بیشتر کاربرد دارد به دلیل اینکه در تاندون داربست هایی حائز اهمیت هستند که خاصیت فیبری داشته باشند و در راستای نیروی وزن گذاری ساختار آن ها توسعه یافته باشد. در فناوری فریز درایینگ، آب درون یک هیدروژل به آرامی تحت خلا و در دمای بسیار پایین تصعید می شود و بنابراین بسته به دمای فریزدرایینگ می توان حفرات با اندازه ها و تنوع گوناگون درون داربست مهندسی شده ایجاد نمود و هیدروژل ها را به سازه های جامد و خشک قابل پیوند تبدیل کرد بدون اینکه ساختار های ملکولی سازه به هم بریزد و به اصطلاح داربست کلاپس کند. داربست های متخلخلی که با استفاده از این فناوری تولید می گردند، شبیه به اسفنج بوده و بیشتر در مهندسی بافت انتسیس تاندون-استخوان کاربرد دارند و نه خود تاندون (۱۰۱ و ۵۴).

چاپ سه بعدی

در قدیم، طراحی داربست ها به صورت دستی انجام می شد و پژوهشگران مجبور بودند داربست ها را در ابعاد مورد علاقه برش و فرم دهند. در سال های اخیر چاپگر های سه و چهاربعدی به تدریج جای خود را در تحقیقات مهندسی بافت باز کرده اند. با استفاده از فناوری چاپگر های سه و چهار بعدی می توان ملکول های مورد نیاز برای ساخت یک سازه را بر اساس برنامه ای از پیش طراحی شده و با دقت بالا پلیمریزه و به صورت یک سازه سه بعدی ساده و یا هوشمند به چاپ رساند. به عنوان مثال می توان تصاویر سه بعدی ام آر آی نقیصه تاندون یک بیمار را به برنامه چاپگر داد و داربست سه بعدی تاندون را چاپ کرد، نمونه ای که به سرعت می تواند توسط جراح در محل نقیصه تاندون پیوند گردد. برخی از داربست های چاپی می توانند حالت هوشمند داشته باشند با  این توضیح که در دماهای مختلف و یا زمان های مختلف به شکل مایع و یا جامد تغییر فاز دهند. با این حال استفاده از چاپگر های سه بعدی و چهاربعدی به دلیل محدودیت هایی که در استفاده از مواد مختلف برای آن ها وجود دارد، نتوانسته اند به سرعت در مهندسی بافت تاندون توسعه یابند. امروزه دسته جدیدی از چاپگر های سه بعدی به نام چاپگر های زیستی در حال توسعه توسط دانشمندان می باشد با این هدف که سلول، مواد محرک ترمیم و زیست موادی مانند کلاژن را بتوان به طور همزمان و منظم تحت چاپ سه بعدی قرار داد؛ امری که نیازمند کراس لینکینگ به صورت همزمان با چاپ می باشد و شرایط تولید سازه های زنده را سخت کرده است (۱۰۳). اخیرا با استفاده از چاپگر زیستی داربست سه بعدی به همراه سلول های بنیادی مزانشیمی ساخته شده است که کاربرد موثر آن در مدل حیوانی خرگوش جهت بازسازی رباط صلیبی در تونل استخوانی نشان داده شده است (۴۳). در مطالعه دیگری نوعی جوهر زیستی از تاندون آشیل گاو ساخته شد و فناوری ای توسعه یافت تا بلافاصله پس از چاپ محلول کلاژنی، عملیات کراس لینکینگ صورت پذیرد و نشان داده شد که محصول ساخته شده زیست سازگاری مطلوبی دارد. استفاده از کلاژن به منظور حداکثر شبیه سازی با محیط تاندون صورت گرفته بود (۱۰۴).

تصویر ۴: نمونه ای از چاپ سه بعدی یک داربست مهندسی شده.

کشت سه بعدی و راکتورهای زیستی

فناوری دیگری در حال توسعه است که موفقیت بیشتری در مهندسی بافت تاندون کسب نموده است و آن استفاده از بیوراکتور ها به منظور کشت سه بعدی سلول های بنیادی در سرتاسر یک داربست و تبدیل سازه مهندسی شده به یک بافت زنده است (۱۰۵). احتمالا تلفیقی از فناوری های چاپ سه بعدی و بیوراکتور می تواند در سال های آینده نوید بخش ساخت بافت های زنده مهندسی شده قابل پیوند به ضایعات تاندون در بیماران باشد؛ امری که هم اکنون در حال توسعه است و با چالش های جدی همراه است (۱۰۶). از فناوری بیوراکتور اخیرا برای ساخت یک تاندون زنده با استفاده از سلول های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان استفاده شده است و تاثیرات مثبتی پس از پیوند این بافت در حین روند ترمیم انتسیس تاندون روتیتور کاف داشته است (۱۱). در مطالعه دیگری نشان داده شده است که تاندون های آسلولار کشت یافته به روش بیوراکتور با سلول های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان پس از پیوند به نقیصه بزرگ تاندون آشیل در خرگوش باعث بهبود خواص مورفولوژیک، ایمونوهیستوشیمی و بیومکانیک تاندون ترمیم یافته شده است (۷۱).

آینده مهندسی بافت

با تحول علم و گذر زمان، آینده مهندسی بافت به سوی واقعیت حرکت می کند. از آن زمان که دانشمندان حوزه مهندسی بنا به خواسته پزشکان سازه هایی غیر کاربردی برای مهندسی بافت تاندون و سایر بافت ها طراحی کردند و شکست های فراوانی در حوزه تحقیق و پژوهش به وجود آمد تا اکنون که پزشکان نیز وارد حوزه های مهندسی بافت شده اند، مهندسی بافت تاندون راه درازی را در مدت زمانی کوتاه سپری کرده است. امروزه ما با روش های مهندسی پزشکی و فناوری های مرتبط با مهندسی بافت به خوبی آشنایی یافته ایم، روند ترمیم تاندون را بهتر از قبل می شناسیم، تحقیقات پایه به بلوغ رسیده اند و نتایج ایده آل گرایانه در واقیعت تحقیقات درون تنی مدل حیوانی با محصولات مهندسی شده تاندون، هضم شده است. آینده از آن تحقیقاتی است که بیشترین شبیه سازی را با نیاز های بدن در زمان ترمیم تاندون انجام دهند و از نزدیک ترین زیست مواد و ساختارها برای ساخت سازه های مهندسی شده تاندون استفاده نمایند. امروز همه ما به خوبی می دانیم که تزریق سلول های بنیادی در زمان فاز التهابی ترمیم تاندون یک خطای پزشکی است، استفاده از داربست هایی که دارای حداکثر مواد سنتزی دیرتخریب پذیر هستند امری اشتباه است، و هر درمانی که بدون توجه به وقایع روند ترمیم تاندون فرد بیمار انجام شود محکوم به شکست است.

 طراحی و چاپ سازه های زیست سازگار و زیست تخریب پذیری که به طور هوشمند عمل نماید می تواند نقش تعیین کننده در بهبود بیمارانی داشته باشد که به نقیصه ها و آسیب های تاندون دچار شده اند. داربست های زیستی سه بعدی که با استفاده از فناوری چاپ سه بعدی به چاپ رسیده اند و درون بیوراکتور، سلول های آماسی و سلول های بنیادی پیش تمایز یافته به سلول های اندوتلیال عروقی و تنوبلاستی در تمامی سطوح و عمق آن ها کشت داده شده باشد؛ دارای عروق اولیه ای باشد که پس از پیوند به سرعت بتواند با عروق خونی بدن ارتباط برقرار نماید، همان بافت زنده ایست که احتمالا حتی بهتر از یک بافت اتوگرافت در روند ترمیم تاندون عمل نماید چراکه چنین بافت زنده ای برای عملکرد خوب در راستای تغییرات فازی روند ترمیم تاندون در محیط آزمایشگاهی آماده شده است و سلول های آن توان مقاومت در برابر تغییرات محیطی را کسب نموده اند. این یکی از صد ها استراتژی در پیوند بافت مهندسی شده تاندون می تواند باشد؛ ولی اینکه در واقعیت بشر بتواند چنین مهمی را عملی نماید نیازمند گذشت زمان و قضاوت تاریخ است.

به عنوان سخن پایانی، در حین طراحی یک استراتژی موثر در ترمیم تاندون های آسیب دیده توجه به مسیر های التهابی وابسته به ماکروفاژ های نوع M2، مسیر های سیگنالینگ و مارکر های تنوژنیک و نیز کنام های سلول های تاندون درون داربست ها، بسیار مهم است و هر محصول مهندسی شده تاندون باید قبل از استفاده در مدل حیوانی در شرایط in vitro به دقت مورد بررسی قرار گرفته و خواص ذاتی آن بیان شود. متاسفانه طیف وسیعی از محصولات مهندسی شده بافتی در سطح بازار های بین المللی وجود دارند که مبنای علمی قوی پشت آن ها نیست، تعداد مطالعات بالینی در انسان و حیوان در این حوزه بسیار کم است و عمده تحقیقات در سطح in vitro و در حدگمانه زنی و تعداد کمی هم تحقیقات مدل حیوانی محدود به جوندگان انجام شده است. ما حصل آنچه گفته شد، نشان می دهد که نیاز به گسترش تحقیقات مدل های حیوانی به خصوص در بیماران بالینی در غالب کارآزمایی بالینی بیش از پیش احساس می شود و تا این ترجمان دانش اتفاق نیفتد، نمی توان در راستای تجاری سازی هیچ محصول مهندسی شده تاندون گام های جدی و عملی برداشت. تاسیس شرکت های دانش بنیان و ورود به عرصه تولیدات مهندسی شده تاندون بدون پیمودن مسیر منطقی علمی ترجمان دانش مهندسی بافت و پزشکی بازساختی تاندون یک خطای استراتژیک است و ممکن است منجر به سوخت سرمایه های علمی در این حوزه گردد.

منابع

۱٫ Moshiri A, Oryan A, Meimandi-Parizi A. Role of tissue-engineered artificial tendon in healing of a large Achilles tendon defect model in rabbits. J Am Coll Surg. 2013;217(3):421-441.e8. 
۲٫ Yan Z, Yin H, Nerlich M, et al. Boosting tendon repair: interplay of cells, growth factors and scaffold-free and gel-based carriers. J Exp Orthop. 2018;5(1):1. doi: 10.1186/s40634-017-0117-1. 
۳٫ Moshiri A, Oryan A, MeimandiParizi A. A novel application of biosynthetic tissue-engineered tridimensional implant on large tendon defects: a comprehensive, detailed, in vivo investigation with significant clinical value. Connect Tissue Res. 2013;54(3):227-43. 
۴٫ Meimandi-Parizi A, Oryan A, Moshiri A, et al. Novel application of a tissue-engineered collagen-based three-dimensional bio-implant in a large tendon  defect model: a broad-based study with high value in translational medicine. Tissue Cell. 2013;45(4):282-94.
۵٫ Oryan A, Moshiri A. A long term study on the role of exogenous human recombinant basic fibroblast growth factor on the superficial digital flexor tendon healing in rabbits. J Musculoskelet Neuronal Interact. 2011;11(2):185-95.
۶٫ Oryan A, Moshiri A, Meimandiparizi AH. Effects of sodium-hyaluronate and glucosamine-chondroitin sulfate on remodeling stage of tenotomized superficial digital flexor tendon in rabbits: a clinical, histopathological, ultrastructural, and biomechanical study. Connect Tissue Res. 2011;52(4):329-39.
۷٫ Andarawis-Puri N, Flatow EL, Soslowsky LJ. Tendon basic science: Development,  repair, regeneration, and healing. J Orthop Res. 2015;33(6):780-4.
۸٫ Oryan A, Moshiri A, Meimandi-Parizi AH. Short and long terms healing of the experimentally transverse sectioned tendon in rabbits. Sports Med Arthrosc Rehabil Ther Technol. 2012;4(1):14. doi: 10.1186/1758-2555-4-14. 
۹٫ Oryan A, Moshiri A, Raayat AR. Novel application of Theranekron® enhanced the  structural and functional performance of the tenotomized tendon in rabbits. Cells Tissues Organs. 2012;196(5):442-55. 
۱۰٫ Meimandi-Parizi A, Oryan A, Moshiri A. Role of tissue engineered collagen based tridimensional implant on the healing response of the experimentally induced large Achilles tendon defect model in rabbits: a long term study with high clinical relevance. J Biomed Sci. 2013;20:28. doi: 10.1186/1423-0127-20-28. 
۱۱٫ Smietana MJ, Moncada-Larrotiz P, Arruda EM, et al. Tissue-Engineered Tendon for Enthesis Regeneration in a Rat Rotator Cuff Model. Biores Open Access. 2017;6(1):47-57. 
۱۲٫ Bussewitz BW. Repair of Neglected Achilles Rupture. Clin Podiatr Med Surg. 2017;34(2):263-274.
۱۳٫ Moshiri A, Oryan A. Structural and functional modulation of early healing of full-thickness superficial digital flexor tendon rupture in rabbits by repeated subcutaneous administration of exogenous human recombinant basic fibroblast growth factor. J Foot Ankle Surg. 2011;50(6):654-62. 
۱۴٫ Moshiri A, Oryan A, Meimandi-Parizi A, et al. Effectiveness of hybridized nano- and microstructure biodegradable, biocompatible, collagen-based, three-dimensional bioimplants in repair of a large tendon-defect model in rabbits. J Tissue Eng Regen Med. 2016;10(6):451-65. 
۱۵٫ Oryan A, Moshiri A, Parizi Meimandi A, et al. A long-term in vivo investigation on the effects of xenogenous based, electrospun, collagen implants  on the healing of experimentally-induced large tendon defects. J Musculoskelet Neuronal Interact. 2013;13(3):353-67. 
۱۶٫ Oryan A, Moshiri A, Parizi AM, et al. Implantation of a novel biologic and hybridized tissue engineered bioimplant in large tendon defect: an in vivo investigation. Tissue Eng Part A. 2014;20(3-4):447-65. 
۱۷٫ Meimandi-Parizi A, Oryan A, Moshiri A. Tendon tissue engineering and its role on healing of the experimentally induced large tendon defect model in rabbits: a  comprehensive in vivo study. PLoS One. 2013;8(9):e73016. 
۱۸٫ Oryan A, Moshiri A, Meimandi-Parizi A. Implantation of a novel tissue-engineered graft in a large tendon defect initiated inflammation, accelerated fibroplasia and improved remodeling of the new Achilles tendon: a comprehensive detailed study with new insights. Cell Tissue Res. 2014;355(1):59-80. 
۱۹٫ Oryan A, Moshiri A, Meimandi-Parizi A. In vitro characterization of a novel tissue engineered based hybridized nano and micro structured collagen implant and its in vivo role on tenoinduction, tenoconduction, tenogenesis and tenointegration. J Mater Sci Mater Med. 2014;25(3):873-97. 
۲۰٫ Moshiri A, Oryan A, Meimandi-Parizi A, et al. Effectiveness of xenogenous-based bovine-derived platelet gel embedded within a three-dimensional  collagen implant on the healing and regeneration of the Achilles tendon defect in rabbits. Expert Opin Biol Ther. 2014;14(8):1065-89. 
۲۱٫ Oryan A, Moshiri A, Meimandi-Parizi A. Role of embedded pure xenogenous bovine platelet gel on experimental tendon healing, modelling and remodelling. BioDrugs. 2014;28(6):537-56. 
۲۲٫ Moshiri A, Oryan A, Meimandiparizi A, et al. Collagen implants I experimental tendon injury in rabbits: a clinical, ultra-structural and biomechanical investigation. J Biol Regul Homeost Agents. 2014;28(3):381-97. 
۲۳٫ Oryan A, Moshiri A, Meimandi-Parizi A, et al. Role of xenogenous bovine  platelet gel embedded within collagen implant on tendon healing: an in vitro and  in vivo study. Exp Biol Med (Maywood). 2015;240(2):194-210. 
۲۴٫ Moshiri A, Oryan A, Meimandi-Parizi A. Synthesis, development, characterization and effectiveness of bovine pure platelet gel-collagen-polydioxanone bioactive graft on tendon healing. J Cell Mol Med. 2015;19(6):1308-32.
۲۵٫ Jin G, He R, Sha B, et al. Electrospun three-dimensional  aligned nanofibrous scaffolds for tissue engineering. Mater Sci Eng C Mater Biol  Appl. 2018 Nov 1;92:995-1005. 
۲۶٫ Rieu C, Picaut L, Mosser G, et al. From Tendon Injury to Collagen-based Tendon Regeneration: Overview and Recent Advances. Curr Pharm Des. 2017;23(24):3483-3506. 
۲۷٫ Li J, Feng X, Liu B, et al. Polymer materials for prevention of postoperative adhesion. Acta Biomater. 2017;61:21-40. 
۲۸٫ Nicodemo MC, Neves LR, Aguiar JC, et al. Amniotic membrane as an option for treatment of acute Achilles tendon injury in rats. Acta Cir Bras. 2017 Feb;32(2):125-139. 
۲۹٫ Hsu SH, Dai LG, Hung YM, et al. Evaluation and characterization of waterborne biodegradable polyurethane films for the prevention of tendon postoperative adhesion. Int J Nanomedicine. 2018;13:5485-5497. 
۳۰٫ Roth SP, Erbe I, Burk J. Decellularization of Large Tendon Specimens: Combination of Manually Performed Freeze-Thaw Cycles and Detergent Treatment. Methods Mol Biol. 2018;1577:227-237. 
۳۱٫ Ning LJ, Jiang YL, Zhang CH, et al. Fabrication and characterization of a decellularized bovine tendon sheet  for tendon reconstruction. J Biomed Mater Res A. 2017;105(8):2299-2311. 
۳۲٫ Roth SP, Glauche SM, Plenge A, et al. Automated freeze-thaw cycles for decellularization of tendon tissue - a pilot study. BMC Biotechnol. 2017 Feb 14;17(1):13. doi: 10.1186/s12896-017-0329-6. 

۳۳٫ Lee AH, Elliott DM. Freezing does not alter multiscale tendon mechanics and damage mechanisms in tension. Ann N Y Acad Sci. 2017;1409(1):85-94.

۳۴٫ Yang JL, Yao X, Qing Q, et al. An engineered tendon/ligament bioscaffold derived from decellularized and demineralized cortical bone matrix. J Biomed Mater Res A. 2018;106(2):468-478. doi: 10.1002/jbm.a.36261. 
۳۵٫ Thangarajah T, Sanghani-Kerai A, Henshaw F, et al. Application of a Demineralized Cortical Bone Matrix and Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells in a Model of Chronic Rotator Cuff Degeneration. Am J Sports Med. 2018;46(1):98-108. 
۳۶٫ Lohan A, Kohl B, Meier C, et al. Tenogenesis of Decellularized Porcine Achilles Tendon Matrix Reseeded with Human Tenocytes in the Nude Mice Xenograft Model. Int J Mol Sci. 2018;19(7). pii: E2059. doi: 10.3390/ijms19072059. 
۳۷٫ Gabler C, Spohn J, Tischer T, et al. Biomechanical, Biochemical, and Cell Biological Evaluation of Different Collagen Scaffolds for Tendon Augmentation. Biomed Res Int. 2018;2018:7246716. 
۳۸٫ Chien C, Pryce B, Tufa SF, et al. Optimizing a 3D model system for molecular manipulation of tenogenesis. Connect Tissue Res. 2018 Jul;59(4):295-308.
۳۹٫ Busra FM, Lokanathan Y, Nadzir MM, et al. Attachment, Proliferation, and Morphological Properties of Human Dermal Fibroblasts on Ovine Tendon Collagen Scaffolds: A Comparative Study. Malays J Med Sci. 2017;24(2):33-43. 

۴۰٫ Kaizawa Y, Leyden J, Behn AW, et al. Human Tendon-Derived Collagen Hydrogel Significantly Improves Biomechanical Properties of the Tendon-Bone Interface in a Chronic Rotator Cuff Injury Model. J Hand Surg Am. 2019. doi: 10.1016/j.jhsa.2018.11.021.

۴۱٫ Yin H, Yan Z, Bauer RJ, et al. Functionalized thermosensitive hydrogel combined with tendon stem/progenitor cells as injectable cell delivery carrier for tendon tissue engineering. Biomed Mater. 2018;13(3):034107. doi: 10.1088/1748-605X/aaadd1. 
۴۲٫ Liao JCY, He M, Gan AWT, et al. The effects of bi-functional anti-adhesion scaffolds on flexor tendon healing in a rabbit model. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2018;106(7):2605-2614. 
۴۳٫ Park SH, Choi YJ, Moon SW, et al. Three-Dimensional Bio-Printed Scaffold Sleeves With Mesenchymal Stem Cells for Enhancement of Tendon-to-Bone Healing in Anterior Cruciate Ligament Reconstruction Using Soft-Tissue Tendon Graft. Arthroscopy. 2018;34(1):166-179. 
۴۴٫ Sharifi-Aghdam M, Faridi-Majidi R, Derakhshan MA, et al. Preparation of collagen/polyurethane/knitted silk as a composite scaffold for tendon tissue engineering. Proc Inst Mech Eng H. 2017;231(7):652-662. 
۴۵٫ Chen E, Yang L, Ye C, et al. An asymmetric chitosan scaffold for tendon tissue engineering: In vitro and in vivo  evaluation with rat tendon stem/progenitor cells. Acta Biomater. 2018;73:377-387. 
۴۶٫ Oryan A, Moshiri A, Meimandi Parizi AH, et al. Repeated administration of exogenous Sodium-hyaluronate improved tendon healing in an in vivo transection model. J Tissue Viability. 2012;21(3):88-102. 
۴۷٫ Dex S, Alberton P, Willkomm L, et al. Tenomodulin is Required for Tendon Endurance Running and Collagen I Fibril Adaptation to Mechanical Load. EBioMedicine. 2017;20:240-254. 
۴۸٫ Perucca Orfei C, Viganò M, Pearson JR, et al. In Vitro Induction of Tendon-Specific Markers in Tendon Cells, Adipose- and Bone Marrow-Derived Stem Cells is Dependent on TGFβ۳,  BMP-12 and Ascorbic Acid Stimulation. Int J Mol Sci. 2019;20(1). pii: E149 
۴۹٫ Arimura H, Shukunami C, Tokunaga T, et al. TGF-β۱ Improves Biomechanical Strength by Extracellular Matrix Accumulation Without Increasing the Number of Tenogenic Lineage Cells in a Rat Rotator Cuff Repair Model. Am J Sports Med. 2017;45(10):2394-2404.
۵۰٫ Bottagisio M, Lopa S, Granata V, et al. Different combinations of growth factors for the tenogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells in monolayer culture and in fibrin-based three-dimensional constructs. Differentiation. 2017;95:44-53. 
۵۱٫ Roth SP, Schubert S, Scheibe P, et al. Growth Factor-Mediated Tenogenic Induction of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells Is Altered by the Microenvironment of Tendon Matrix. Cell Transplant. 2018;27(10):1434-1450. 
۵۲٫ Dale TP, Mazher S, Webb WR, et al. Tenogenic Differentiation of Human Embryonic Stem Cells. Tissue Eng Part A. 2018 Mar;24(5-6):361-368. 
۵۳٫ di Giacomo V, Berardocco M, Gallorini M, et al. Combined supplementation of ascorbic acid and thyroid hormone T(3) affects tenocyte proliferation. The effect of ascorbic acid in the production of nitric oxide. Muscles Ligaments Tendons J. 2017;7(1):11-18.
۵۴٫ Kim JH, Oh SH, Min HK, et al. Dual growth factor-immobilized asymmetrically porous membrane for bone-to-tendon interface regeneration on rat patellar tendon  avulsion model. J Biomed Mater Res A. 2018;106(1):115-125. 
۵۵٫ Kraus A, Sattler D, Wehland M, et al. Vascular Endothelial Growth Factor Enhances Proliferation of Human Tenocytes and Promotes  Tenogenic Gene Expression. Plast Reconstr Surg. 2018;142(5):1240-1247. 
۵۶٫ de Aro AA, Carneiro GD, Teodoro LFR, et al. Injured Achilles Tendons Treated  with Adipose-Derived Stem Cells Transplantation and GDF-5. Cells. 2018;7(9). pii: E127. doi: 10.3390/cells7090127. 
۵۷٫ Hou Y, Ni M, Lin S, et al. Tenomodulin highly expressing MSCs as a better cell source for tendon injury healing. Oncotarget. 2017;8(44):77424-77435. 
۵۸٫ Le W, Yao J. The Effect of Myostatin (GDF-8) on Proliferation and Tenocyte Differentiation of Rat Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. J Hand Surg Asian Pac Vol. 2017;22(2):200-207. 
۵۹٫ Costa-Almeida R, Franco AR, Pesqueira T, et al. The effects of platelet lysate patches on the activity of  tendon-derived cells. Acta Biomater. 2018;68:29-40..
۶۰٫ Zhang CH, Jiang YL, Ning LJ, et al. Evaluation of Decellularized Bovine Tendon Sheets for Achilles Tendon Defect Reconstruction in a Rabbit Model. Am J Sports Med. 2018;46(11):2687-2699. 
۶۱٫ Zhang J, Yuan T, Zheng N, et al. The combined use of kartogenin and platelet-rich plasma promotes fibrocartilage formation in the wounded rat Achilles tendon entheses. Bone Joint Res. 2017;6(4):231-244. 
۶۲٫ Freeberg MAT, Farhat YM, Easa A, et al. Serpine1 Knockdown Enhances MMP Activity after Flexor Tendon Injury in Mice: Implications for Adhesions Therapy. Sci Rep. 2018;8(1):5810. doi: 10.1038/s41598-018-24144-1. 
۶۳٫ de Lima Santos A, Silva CGD, de Sá Barretto LS, et al. Biomechanical evaluation of tendon regeneration with adipose-derived stem cell. J Orthop Res. 2018. doi: 10.1002/jor.24182. 
۶۴٫ Costa-Almeida R, Calejo I, Reis RL, et al. Crosstalk between adipose stem cells and tendon cells reveals a temporal regulation of tenogenesis by matrix deposition and remodeling. J Cell Physiol. 2018;233(7):5383-5395. 
۶۵٫ Long C, Wang Z, Legrand A, et al. Tendon Tissue Engineering: Mechanism and Effects of Human Tenocyte Coculture With Adipose-Derived Stem Cells. J Hand Surg Am. 2018 Feb;43(2):183.e1-183.e9. doi: 10.1016/j.jhsa.2017.07.031. 
۶۶٫ Cai J, Yang Y, Ai C, et al. Bone Marrow Stem Cells-Seeded Polyethylene Terephthalate Scaffold in Repair and Regeneration of Rabbit Achilles Tendon. Artif Organs. 2018;42(11):1086-1094. 
۶۷٫ Gonçalves AI, Gershovich PM, Rodrigues MT, et al. Human adipose tissue-derived tenomodulin positive subpopulation of stem cells: A promising source of tendon progenitor cells. J Tissue Eng Regen Med. 2018;12(3):762-774. 
۶۸٫ Long C, Galvez MG, Legrand A, et al. Intratendinous Injection of Hydrogel for Reseeding Decellularized Human Flexor Tendons. Plast Reconstr Surg. 2017;139(6):1305e-1314e. 
۶۹٫ Sevivas N, Teixeira FG, Portugal R, et al. Mesenchymal Stem Cell Secretome Improves Tendon Cell Viability In Vitro and Tendon-Bone Healing In Vivo When a Tissue Engineering Strategy Is Used in a Rat Model of Chronic Massive Rotator Cuff Tear. Am J Sports Med. 2018 Feb;46(2):449-459. 
۷۰٫ Chen J, Zhang E, Zhang W, et al. Fos Promotes Early Stage Teno-Lineage Differentiation of Tendon Stem/Progenitor Cells in Tendon. Stem Cells Transl Med. 2017;6(11):2009-2019. 

۷۱٫ Xie S, Zhou Y, Tang Y, et al. Book-shaped decellularized tendon matrix scaffold combined with bone marrow mesenchymal stem cells-sheets for repair of Achilles tendon defect in Rabbit. J Orthop Res. 2019. doi:10.1002/jor.24255.

۷۲٫ Chamberlain CS, Clements AEB, Kink JA, et al. Extracellular Vesicle-Educated Macrophages Promote Early Achilles Tendon Healing. Stem Cells. 2019. doi: ۱۰٫۱۰۰۲/stem.2988.

۷۳٫ Zhang YJ, Qing Q, Zhang YJ, et al. Enhancement of tenogenic differentiation of rat tendon-derived stem cells by biglycan. J Cell Physiol. 2019. doi: 10.1002/jcp.28247.

۷۴٫ Bogdanowicz DR, Lu HH. Designing the stem cell microenvironment for guided connective tissue regeneration. Ann N Y Acad Sci. 2017;1410(1):3-25. doi: 10.1111/nyas.13553. Review. 
۷۵٫ Sun J, Mou C, Shi Q, et al. Controlled release of collagen-binding SDF-1α from the collagen scaffold promoted tendon regeneration in a rat Achilles tendon defect model. Biomaterials. 2018;162:22-33. 
۷۶٫ Vinhas A, Rodrigues MT, Gomes ME. Exploring Stem Cells and Inflammation in Tendon Repair and Regeneration. Adv Exp Med Biol. 2018;1089:37-46. 

۷۷٫ Li J, Stoppato M, Schiele NR, et al. Embryonic and postnatal tendon cells respond differently to interleukin-1β. Ann N Y Acad Sci. 2019. doi: 10.1111/nyas.14013.

۷۸٫ Chamberlain CS, Saether EE, Aktas E, et al. Mesenchymal Stem Cell Therapy on Tendon/Ligament Healing. J Cytokine Biol. 2017;2(1). pii: 112. 
۷۹٫ Tarafder S, Chen E, Jun Y, et al. Tendon stem/progenitor cells regulate inflammation in tendon healing via JNK and STAT3 signaling. FASEB J. 2017;31(9):3991-3998. 
۸۰٫ Shen H, Jayaram R, Yoneda S, et al. The effect of adipose-derived stem cell sheets and CTGF on early flexor tendon healing in a canine model. Sci Rep. 2018;8(1):11078. doi: 10.1038/s41598-018-29474-8.
۸۱٫ Gelberman RH, Linderman SW, Jayaram R, et al. Combined Administration of ASCs and BMP-12 Promotes an  M2 Macrophage Phenotype and Enhances Tendon Healing. Clin Orthop Relat Res. 2017;475(9):2318-2331. 
۸۲٫ Cui H, He Y, Chen S, et al. Macrophage-Derived miRNA-Containing Exosomes Induce Peritendinous Fibrosis after Tendon Injury through the miR-21-5p/Smad7 Pathway. Mol Ther Nucleic Acids. 2019;14:114-130. 
۸۳٫ Wang W, Deng D, Wang B, et al. (*) Comparison of Autologous, Allogeneic, and Cell-Free Scaffold Approaches for Engineered Tendon Repair in a Rabbit Model-A Pilot Study. Tissue Eng Part A. 2017;23(15-16):750-761. 
۸۴٫ Song H, Yin Z, Wu T, et al. Enhanced Effect of Tendon Stem/Progenitor Cells Combined With Tendon-Derived Decellularized Extracellular Matrix on Tendon Regeneration. Cell Transplant. 2018:963689718805383. doi: 10.1177/0963689718805383. 
۸۵٫ Wang ML, Beredjiklian PK, Steplewski A, et al. Engineering the  Second Generation of Therapeutic Cells with Enhanced Targeting of Injured Tissues. Tissue Eng Part A. 2018;24(15-16):1293-1300. 
۸۶٫ de Girolamo L, Ragni E, Cucchiarini M, et al. Cells, soluble factors and matrix harmonically play the concert of allograft integration. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 2018. doi: 10.1007/s00167-018-5182-1. 
۸۷٫ McGoldrick R, Chattopadhyay A, Crowe C, et al. The Tissue-Engineered Tendon-Bone Interface:  In Vitro and In Vivo Synergistic Effects of Adipose-Derived Stem Cells, Platelet-Rich Plasma, and Extracellular Matrix Hydrogel. Plast Reconstr Surg. 2017;140(6):1169-1184. 
۸۸٫ Kim YS, Sung CH, Chung SH, et al. Does an Injection of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells Loaded in Fibrin Glue Influence Rotator Cuff Repair Outcomes? A Clinical and Magnetic Resonance Imaging Study. Am J Sports Med. 2017;45(9):2010-2018. 
۸۹٫ Govoni M, Berardi AC, Muscari C, et al. (*) An Engineered Multiphase  Three-Dimensional Microenvironment to Ensure the Controlled Delivery of Cyclic Strain and Human Growth Differentiation Factor 5 for the Tenogenic Commitment of  Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells. Tissue Eng Part A. 2017;23(15-16):811-822. 
۹۰٫ Freiman A, Shandalov Y, Rosenfeld D, et al. Engineering vascularized flaps using adipose derived microvascular endothelial cells and mesenchymal stem cells. J Tissue Eng Regen Med. 2018;12(1):e130-e141. 
۹۱٫ Frauz K, Teodoro LFR, Carneiro GD, et al. Transected Tendon Treated with a New Fibrin Sealant Alone or Associated with Adipose-Derived Stem Cells. Cells. 2019;8(1). pii: E56. doi: 10.3390/cells8010056. 
۹۲٫ Manoukian OS, Matta R, Letendre J, et al. Electrospun Nanofiber Scaffolds and Their Hydrogel Composites for the Engineering and Regeneration of Soft Tissues. Methods Mol Biol. 2017;1570:261-278. 
۹۳٫ Sensini A, Cristofolini L. Biofabrication of Electrospun Scaffolds for the Regeneration of Tendons and Ligaments. Materials (Basel). 2018;11(10). pii: E1963. doi: 10.3390/ma11101963. 

۹۴٫ Rinoldi C, Costantini M, Kijeńska-Gawrońska E, et al. Tendon Tissue Engineering: Effects of Mechanical and Biochemical Stimulation on Stem Cell Alignment on Cell-Laden Hydrogel Yarns. Adv Healthc Mater. 2019:e1801218. doi: 10.1002/adhm.201801218.

۹۵٫ Wu S, Wang Y, Streubel PN, et al. Living nanofiber yarn-based woven biotextiles for tendon tissue engineering using cell tri-culture and mechanical stimulation. Acta Biomater. 2017;62:102-115. 
۹۶٫ Zhang B, Luo Q, Deng B, et al. Construction of tendon replacement tissue based on collagen sponge and mesenchymal stem cells by coupled mechano-chemical induction and evaluation of its tendon repair abilities. Acta Biomater. 2018;74:247-259.
۹۷٫ Wang T, Thien C, Wang C, et al. 3D uniaxial mechanical stimulation induces tenogenic differentiation of tendon-derived stem cells through a PI3K/AKT signaling pathway. FASEB J. 2018;32(9):4804-4814. 
۹۸٫ Learn GD, McClellan PE, Knapik DM, et al. Woven collagen biotextiles enable mechanically functional  rotator cuff tendon regeneration during repair of segmental tendon defects in vivo. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2018. doi: 10.1002/jbm.b.34279.  
۹۹٫ Nitti P, Gallo N, Natta L, et al. Influence of Nanofiber Orientation on Morphological and Mechanical Properties of  Electrospun Chitosan Mats. J Healthc Eng. 2018;2018:3651480. doi: 10.1155/2018/3651480. 
۱۰۰٫ Schoenenberger AD, Foolen J, Moor P, et al. Substrate fiber alignment mediates tendon cell response to inflammatory signaling. Acta Biomater. 2018 Apr 15;71:306-317. 

۱۰۱٫ Olvera D, Schipani R, Sathy BN, et al. Electrospinning of highly porous yet mechanically functional microfibrillar scaffolds at the human scale for ligament and tendon tissue engineering. Biomed Mater. 2019. doi:10.1088/1748-605X/ab0de1.

۱۰۲٫ Patel JM, Jackson RC, Schneider GL, et al. Carbodiimide cross-linking counteracts the detrimental effects of gamma irradiation on the physical properties of collagen-hyaluronan sponges. J Mater Sci Mater Med. 2018;29(6):75. 
۱۰۳٫ Scholze M, Singh A, Lozano PF, et al. Utilization of 3D printing technology to facilitate and standardize soft tissue testing. Sci Rep. 2018 Jul 27;8(1):11340. doi: 10.1038/s41598-018-29583-4. 
۱۰۴٫ Toprakhisar B, Nadernezhad A, Bakirci E, et al. Development of Bioink from Decellularized Tendon Extracellular Matrix for 3D Bioprinting. Macromol Biosci. 2018 Oct;18(10):e1800024. doi: 10.1002/mabi.201800024. 
۱۰۵٫ Peroglio M, Gaspar D, Zeugolis DI, et al. Relevance of bioreactors and whole tissue cultures for the translation of new therapies to humans. J Orthop Res. 2018;36(1):10-21. 
۱۰۶٫ Raveling AR, Theodossiou SK, Schiele NR. A 3D printed mechanical bioreactor for investigating mechanobiology and soft tissue mechanics. MethodsX. 2018;5:924-932.